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黄莉清，苏娇娇，王黔阳，彭丽娟，何珺
(1.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025；
2.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025；
3.贵州大学 烟草学院，贵州 贵阳 550025)
我国银杏资源约占全世界总量的75%，其中银杏叶产量占世界总产量90%以上[1-2]，银杏叶提取物市场药用价值极高[3-5]。银杏叶提取物每年生产中产生废弃提取粘渣约2 000 t，其中银杏酚酸含量约为17%，近300 t银杏酚酸排废丢弃，会引起污染环境人或畜中毒[6-7]。
银杏酚酸具有抗肿瘤、抑菌、杀虫等活性[8-9]。银杏叶中银杏酚酸的相关研究正逐年上升[10]，集中在其脱除研究[11-12]，对银杏酚酸的提纯再利用较少。本文以银杏叶生产提取物醇提液浓缩加水静置沉淀产生水沉的废渣为原料，研究HPD-5000型大孔树脂纯化银杏酚酸的工艺，回收纯化银杏酚酸组分，对银杏资源的综合利用及环境保护具有重要意义。
1.1 材料与仪器
银杏叶提取物生产水沉废渣，于2022年 1月 12 号取自贵州北极兴药业有限公司；
对照品白果新酸(批号111594-20160)由中检院提供；
HPD-5000、LX-60、D101、AB-8、DM130、DA201均由西安蓝晓科技材料股份有限公司提供；
无水乙醇、甲醇、石油醚(60-90)、三氟乙酸均为分析纯；
乙腈，色谱级；
娃哈哈水(贵阳娃哈哈昌盛饮料有限公司)。
LC-2040C 3D超高效液相色谱仪；
KQ3200DE数控超声波清洗器；
BSA1245电子天平；
HH-1水浴加热锅。
1.2 银杏酚酸HPLC含量测定
1.2.1 HPLC测定色谱条件 色谱柱：Supersil-U C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%三氟乙酸水(0 min 75∶25→30 min 90∶10→35 min 90∶10→35.5 min 75∶25→38 min 75∶25)，检测波长310 nm，进样量50 μL，柱温45 ℃，流速 1 mL/min，分析时间40 min。
1.2.2 对照品溶液的制备 精密称定适量白果新酸对照品，置于容量瓶中，加入甲醇超声溶解，定容，摇匀，配制成质量浓度为3.44 μg/mL银杏酚酸的对照品溶液。
1.2.3 白果新酸标准曲线的制作 精密吸取白果新酸对照品溶液1，2，2.5，5，10 mL，加入甲醇定容至10 mL，振荡均匀后按1.2.1节HPLC色谱条件进行分析，以白果新酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线的线性回归方程为：y=34 959x+4 051.6，R2=0.998 2，表明白果新酸浓度范围在0.334～3.44 μg/mL时有良好的线性相关性。
1.2.4 供试品含量测定 精密称取0.01 g置于 10 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解，定容，摇匀，得供试品。按1.2.1节进行检测分析，得HPLC色谱图见图1、图2。
图1 对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of reference substance
图2 纯化产品色谱图Fig.2 Chromatogram of purified product
1.3 银杏酚酸大孔树脂分离工艺筛选
1.3.1 树脂预处理 将HPD-5000、LX-60、AB-8、DM130、DA201 五种型号树脂用5% NaOH浸泡 3～5 h，水洗至中性，再用5% 盐酸浸泡3～5 h，水洗至中性，70%乙醇溶液平衡树脂，备用。
1.3.2 银杏酚酸上柱原料液制备 取100 g银杏叶提取物生产水沉渣作为原料，用料液比为1∶2甲醇搅拌溶解，离心去不溶沉淀后，加200 mL石油醚萃取，补适量水使分层明显后，取石油醚层浓缩为萃取浸膏。再采用70%乙醇溶解萃取浸膏得银杏酚酸上柱液。
2.1 静态吸附实验
称取预处理后的树脂各5 g，分别置于三角瓶中，各添加50 mL 2.308 5 mg/mL银杏酚酸原料液，置25 ℃恒温、180 r/min摇床振荡吸附24 h，使银杏酚酸充分吸收；
滤过，吸干树脂表面水分，加入95%乙醇，各70 mL，25 ℃恒温、180 r/min摇床振荡解析 24 h，使银杏酚酸充分解吸。检测滤液和洗脱液中银杏酚酸的含量，并计算饱和吸附量和解析率，吸附率=(银杏酚酸吸附量/上样液中银杏酚酸总量)×100%，解析率=(银杏酚酸解吸附量/银杏酚酸吸附量)×100%，结果见表1。
表1 银杏酚酸不同大孔树脂的静态吸附和 解析性能(n=2)Table 1 Static adsorption and analytical properties of different macroporous resins of ginkgolic acid
由表1可知，DA201树脂的吸附率及纯度最高，其次是HPD-5000及DM130。但由于银杏叶提取物工业生产中常用HPD-5000脱酸、DM130吸附黄酮，因此综合工业生产现有条件及成本消耗等角度考虑，选用HPD-5000进行深入研究。
2.2 上样流速的筛选
取30 mL HPD-5000树脂3份湿法装柱，分别装入相同规格的层析柱中，各取200 mL 2.226 7 mg/mL银杏酚酸原料液，并各以1，2，3 BV/h 的流速上样，分别收集3份上样流出液并测定其银杏酚酸含量，结果见图3。
图3 不同上样流速吸附结果Fig.3 Adsorption results at different samples flow rate
由图3可知，随着上样流速的加快，流出液中的银杏酚酸含量越多，目标物丢失越大，大孔树脂吸附效果越差。因此，综合考虑选择上样流速为1 BV/h。
2.3 洗脱剂乙醇浓度筛选
取100 mL HPD-5000树脂湿法装柱，160 mL银杏酚酸原料液1 BV/h上柱，2 BV 70%乙醇除杂，依次用3 BV 75%，80%，90%乙醇洗脱，收集不同浓度洗脱液，浓缩为浸膏并测定银杏酚酸含量，结果见图4。
由图4可知，70%乙醇中几乎不含银杏酚酸，90%乙醇洗脱剂中富集大量银杏酚酸，因此选择乙醇浓度为70%乙醇除杂，90%乙醇为洗脱剂。
图4 不同浓度乙醇洗脱液洗脱结果Fig.4 Elution results of different concentrations of ethanol eluent
2.4 洗脱剂用量的筛选
取100 mL HPD-5000树脂湿法装柱，160 mL银杏酚酸原料液1 BV/h上柱，2 BV 70%乙醇除杂，用90%乙醇洗脱，每100 mL收集1份洗脱液，检测每份洗脱液中银杏酚酸含量，结果见图5。
图5 洗脱剂用量筛选结果Fig.5 Screening results of eluent dosage
由图5可知，第2 BV流份的银杏酚酸洗脱量达到最高，当接到第4 BV时银杏酚酸量开始极少，从成本及纯度等角度综合考虑，确定选用4 BV 90%乙醇为最佳洗脱剂用量。
2.5 树脂最佳径高比的筛选
取3根不同规格的层析柱，使相同体积大孔树脂湿法装柱后径高比分别为1∶4，1∶6，1∶8，取相同浓度相同体积银杏酚酸原料液，1 BV/h上样，2 BV 70%乙醇除杂，4 BV 90%乙醇洗脱，收集洗脱液，旋干为浸膏测银杏酚酸含量，结果见图6。
图6 树脂径高比筛选结果Fig.6 Screening results of resin diameter-to-height ratio
由图6可知，当径高比为1∶6和1∶8时银杏酚酸含量都较高，但从成本及效果综合考虑，确定1∶6为最佳树脂径高比。
2.6 银杏叶提取物废渣中银杏酚酸HPD-5000树脂分离工艺验证
精密称取3份100 g银杏叶提取物废渣，用甲醇料液比为1∶12，温度40 ℃，加热回流提取 90 min，浓缩提取液得到银杏酚酸提取浸膏。用 200 mL 热水溶解提取浸膏，按料液比1∶2加入乙酸乙酯萃取2次浓缩得到银杏酚酸萃取浸膏。用70%乙醇溶解萃取浸膏得银杏酚酸上柱液。分别精密量取200 mL HPD-5000树脂，湿法装柱到径高比为1∶6 的层析柱中，上样流速为1 BV/h，2 BV 70%乙醇除杂，4 BV 90%乙醇洗脱，收集洗脱液，旋干为浸膏测银杏酚酸含量，相关数据见表2、表3。
表2 银杏酚酸提纯工艺验证(n=3)Table 2 Validation of ginkgolic acid purification process
表3 银杏酚酸提纯含量验证(n=3)Table 3 Validation of purified content of ginkgolic acid
由表2、表3可知，3次平行验证实验的RSD值为1.77%，小于2%，说明该银杏叶提取物废渣中银杏酚酸HPD-5000树脂分离工艺验证重复性好，工艺稳定可行。
本文以银杏叶提取物生产过程中产生的水沉废渣为原料，采用大孔吸附树脂方法分离纯化工艺研究。对HPD-5000、LX-60、AB-8、DM130、DA201 5种型号树脂进行静态吸附实验，综合考察，选用HPD-5000型树脂作为银杏叶提取物废渣中分离银杏酚酸的吸附树脂。确定分离纯化工艺为：以HPD-5000型树脂为柱层析树脂，上样流速1 BV/h，洗脱剂乙醇浓度为70%除杂、90%洗脱，90%乙醇洗脱剂体积为4 BV，树脂径高比1∶6。该工艺可以将银杏叶提取物废渣中17%银杏酚酸含量有效提升至77.87% 。
银杏叶提取物废渣中银杏酚酸的提取工艺目前相关报道极少，本实验采用大孔吸附树脂的方法对银杏叶提取物废渣中银杏酚酸进行分离纯化，结果显示大孔树脂纯化后银杏酚酸富集效果明显。该工艺操作简单，周期短，树脂可重复利用，有利于银杏叶药材资源综合开发利用及生产。
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