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陈大伟，刘 敏，唐修君，陆俊贤，赵 敏，刘茵茵，马丽娜，周 倩，王 娟，高玉时
(1. 江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125 ；
2. 江苏威特凯鸽业有限公司，江苏 无锡 214415 ；
3. 江都区武坚镇农业农村局，江苏 扬州 225253)
随着居民生活水平和消费的提高，对禽肉产品质量安全要求也逐渐增强。乳鸽肉质鲜美，富含的氨基酸、脂肪酸构成合理，并具有一定的药用价值，近年来乳鸽消费群体逐年增加[1]。与其他家禽不同，乳鸽自出壳到28日龄上市，主要以种鸽分泌的鸽乳作为营养物质来源[2]。因此，亲鸽用药后可能传递到乳鸽体内造成药物残留。
毛滴虫病是困扰养鸽业的重要寄生虫病之一[3]，目前用于预防和治疗该病的主要药物是硝基咪唑类，如地美硝唑。农业农村部公告中规定地美硝唑在饲养动物中可以使用，但产品中不得检出[4]。农业农村部第278号公告规定鸡使用地美硝唑的休药期为28 d[5]，但对鸽子使用后的休药期暂无规定。养殖户一般参照鸡的休药期进行操作，但因休药期时间太长，与乳鸽的上市时间相同，导致药物使用后的休药期可操作性降低。这也是目前鸽产品中硝基咪唑类药物常有检出的重要原因。因此，亟需研究地美硝唑在鸽体内的残留代谢规律，制定相应的休药期规则，指导生产。
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 地美硝唑(Dimetridazole，DMZ)和地美硝唑-D3(Dimetridazole-D3，DMZ-D3)标准品，均购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；
羟甲基甲硝咪唑(Hydroxy dimetridazole，HMMNI)和羟甲基甲硝咪唑-D3(Hydroxy dimetridazole-D3，HMMNI-D3)标准品，均购自加拿大TRC公司；
色谱纯级甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷，均购自上海安谱实验科技股份有限公司；
20%地美硝唑预混剂，购自广州白云山宝神动物保健品股份有限公司。
1.1.2 主要仪器 TSQ QUANTUM ACCESS MAX液相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司产品)；
3-30K高速冷冻离心机(德国Sigma公司产品)；
N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司产品)；
Milli-Q Academic超纯水仪(美国Millipore公司产品)。
1.1.3 试验动物 哺乳亲鸽80对，每对亲鸽哺乳2只乳鸽，由无锡威特凯鸽业有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 分组与处理 80对亲鸽随机分为饲喂组和灌胃组，于相同时间开始哺育乳鸽(1日龄)，饲喂组进行拌料给予DMZ(2.5 g/kg)，灌胃组进行灌服给予DMZ(0.375 g/只)，连续给药5 d。本试验采用的试验剂量为鸽场生产中实际使用的剂量，通过现场调查证实生产中使用该剂量对鸽生产性能和健康无明显影响。
1.2.2 样品采集与制备 分别在给药后第1、4、7、10、13、16、19、22、25、28天随机屠宰各组6只亲鸽和6只乳鸽，采集亲鸽和乳鸽肌肉、肝脏、肾脏、皮脂，以及乳鸽嗉囊内的鸽乳。胸肌、肝脏、肾脏和皮脂用绞肉机进行充分均质，1只亲鸽的每种组织分别制备1个样品。乳鸽第7天前体重较小，2只乳鸽的相同组织合并制备1个样品，第7天及以后样品制备方法与亲鸽相同。鸽乳经冷冻干燥后研磨成粉作为测定样品。
1.2.3 标准曲线绘制 准确称取DMZ、DMZ-D3、HMMNI和HMMNI-D3标准品，用乙腈溶解，配制成400 mg/L的标准储备液。分别移取适量标准储备液，用0.1% (体积分数)甲酸水溶液稀释，配制成100 ng/mL的混合标准中间液；
最后用空白基质溶液配制成质量浓度为1、2、5、10、15、20、50和100 μg/L 的系列混合标准工作液(标液)，内标浓度为10 μg/L。
1.2.4 样品检测前处理 以标液浓度为横坐标(X),外标和内标峰面积比为纵坐标(Y)绘制标准曲线。准确称取(2.00±0.01)g样品于50 mL离心管内，加入乙酸乙酯8.0 mL，涡旋1 min，高速振荡提取5 min，12 000 r/min离心5 min。转移全部上清液到15 mL离心管中，45 ℃下氮气吹干，加入4 mL正己烷+2.0 mL 0.1%甲酸水溶液+甲醇(90+10，V+V)溶液，涡旋混匀，10 000 r/min离心5 min(5 ℃)，去除正己烷层，下层置于装有50 mg乙二胺-N-丙基硅烷(Primary secondary amine,PSA)粉末的2 mL离心管中，涡旋混匀，8 000 r/min离心5 min(5 ℃)。吸取适量上清液过0.2 μm微孔滤膜后用液相色谱串联质谱法测定样品中DMZ和HMMNI含量。
1.2.5 色谱条件 色谱柱：Hypersil GOLD C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美国 Thermo 公司)；
柱温：30 ℃；
进样量：10 μL。流动相：A 为0.1% (体积分数)甲酸水溶液，B为乙腈；
流速：0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0～1.5 min，流动相B由5%变为20%，流速0.3 mL/min；
1.5～4.0 min，流动相B由20%变为30%，流速0.3 mL/min；
4.0～4.5 min，流动相B维持30%，流速0.3 mL/min；
4.5～4.6 min，流动相B由30%变为5%，流速0.3 mL/min；
4.6～6.5 min，流动相B维持5%，流速0.3 mL/min。
1.3 统计分析 试验结果以“平均值±标准差”方式表示。采用Excel软件进行数据制图。
2.1 标准曲线绘制 DMZ和HMMNI在0～100 μg/L(内标浓度为10 μg/L)浓度范围内外标和内标的峰面积比(Y)和浓度(X)呈现良好的线性关系，其线性方程分别为：Y=0.034 856 2X+0.000 993 288和Y=0.024 757 7X+0.022 565 9，相关系数R2分别为0.997 8和0.999 3(图1和图2)。方法回收率和精密度均能满足检测要求(数据未列出)。
图1 地美硝唑标准曲线
图2 地美硝唑代谢物(羟甲基甲硝咪唑)标准曲线
2.2 饲喂方式亲鸽和乳鸽药物残留及消除规律 饲喂方式亲鸽组织中DMZ及其代谢物残留消除规律见图3，亲鸽饲喂DMZ后第1天肌肉、肝脏、肾脏和皮脂中DMZ及其代谢物残留量均达到峰值，肌肉中最高残留量为200.9 μg/kg，肾脏、肝脏和皮脂最高残留量相当，分别为902.9 μg/kg、999.3 μg/kg和961.3 μg/kg；
肌肉中药物消除曲线较为平缓，与第1天比较，第4天残留量下降率为58.2%，第16天无残留检出；
肝脏、肾脏和皮脂中药物消除曲线较为陡峭，与第1天比较，第4天残留量下降率分别为66.2%、70.5%和64.4%，第19天均完全无残留检出。因此，饲喂方式给药后亲鸽肌肉、肝脏、肾脏和皮脂中药物消除时间分别为16 d、19 d、19 d和19 d。
图3 饲喂给药方式亲鸽组织中地美硝唑及其代谢物残留消除规律
亲鸽饲喂方式给予DMZ后，乳鸽组织中DMZ及其代谢物残留消除规律见图4，乳鸽组织中DMZ及其代谢物最高残留量与亲鸽同步，均出现在第1天；
乳鸽肌肉中最高残留量为24.4 μg/kg，与第1天比较，第4天残留量下降率为47.3%，第16天完全无检出；
肝脏、肾脏和皮脂中药物消除规律与亲鸽类似，最高残留量分别为150.2 μg/kg、175.4 μg/kg和59.6 μg/kg，与第1天比较，第4天残留量下降率为52.6%、54.8%和88.9%，并分别于第16天、第16天和第13天完全无残留检出。因此，亲鸽饲喂给予DMZ后乳鸽肌肉、肝脏、肾脏和皮脂中药物消除时间分别为16 d、16 d、16 d和13 d。
图4 饲喂给药方式乳鸽组织中地美硝唑及其代谢物残留消除规律
2.3 灌胃方式亲鸽和乳鸽药物残留及消除规律 灌胃方式给药后，亲鸽组织中DMZ及其代谢物残留消除规律见图5，DMZ及其代谢物残留量在灌胃给药后第1天即达到峰值，然后迅速下降，肌肉、肝脏、肾脏和皮脂第1天残留量分别为329.3 μg/kg、1 337.2 μg/kg、1 104.9 μg/kg和6 591.7 μg/kg，与第1天比较，第4天各组织残留量下降率分别为44.6%、62.7%、66.2%和98.2%，并分别于第22、22、19、19天完全无残留检出。因此，灌胃方式给药后亲鸽肌肉、肝脏、肾脏和皮脂中药物消除时间分别为22 d、22 d、19 d和19 d。
图5 灌胃给药方式亲鸽组织地美硝唑及其代谢物残留消除规律
亲鸽灌胃方式给予DMZ后，乳鸽组织中DMZ及其代谢物残留消除规律见图6，与亲鸽类似，乳鸽各组织中DMZ及其代谢物第1天残留量最高，且残留量最高的组织也是皮脂；
肌肉、肝脏、肾脏和皮脂中第1天残留量分别为39.3 μg/kg、178.9 μg/kg、168.7 μg/kg和500.7 μg/kg，与第1天比较，第4天各组织残留量下降率分别为59.1%、48.5%、53.7%和95.7%，并分别于第13、19、16、13天完全无残留检出。因此，亲鸽灌胃给予DMZ后乳鸽肌肉、肝脏、肾脏和皮脂中药物消除时间分别为13 d、19 d、16 d和13 d。
图6 灌胃给药方式乳鸽组织地美硝唑及其代谢物残留消除规律
2.4 鸽乳中DMZ及其代谢物残留量 部分日龄鸽乳形态见图7，乳鸽在0～7日龄完全靠亲鸽分泌的鸽初乳维持生长，此时的鸽乳为全浆料，乳白色，有酸败气味，表面可见油状物，是由亲鸽嗦囊黏膜上皮细胞的脱落物和细胞碎片组成；
7日龄开始，鸽乳中逐渐包含了消化不完全的饲粮颗粒；
由22日龄鸽乳形态可知，乳鸽生长中后期采食的鸽乳的主要成分逐渐转变为亲鸽采食的饲料。2种给药方式下鸽乳中DMZ及其代谢物残留消除规律见图8，饲喂方式下鸽乳中初始药物残留浓度相对较高，约11 μg/kg；
2种给药方式下第10天鸽乳中均无药物检出。
图7 部分日龄鸽乳形态
图8 鸽乳中地美硝唑及其代谢物残留消除规律
液相色谱串联质谱法是动物性食品中硝基咪唑类残留检测的主流方法[6]。本试验采用本课题组前期建立的鸡肉、鸡蛋中硝基咪唑类检测方法[7]，经验证后应用到鸽肌肉、肝脏、肾脏、皮脂和鸽乳中DMZ及其代谢物的检测，回收率和精密度均能满足要求，为下一步开展DMZ在鸽体内的残留代谢规律研究奠定基础。
鸽毛滴虫病是严重危害肉鸽养殖的一种寄生虫病，在鸽群中普遍流行[8-12]。鸽群可通过直接接触虫体或间接接触被污染的饲料和水源等感染毛滴虫[13]。国内外流行病学调查结果显示，鸽毛滴虫感染率在14.9%～77.8%[14-18]。研究发现，乳鸽感染毛滴虫主要来自种鸽的哺乳行为[11]。因此，预防和治疗鸽毛滴虫病主要用药对象是亲鸽。现阶段预防和治疗毛滴虫病的主要手段仍然是采用化学药物，但化学药物使用后的残留问题一直是困扰养殖户的技术难题。目前，对鸽毛滴虫病防治效果较好，且临床使用较多的药物仍然是硝基咪唑类，主要是DMZ。DMZ为新型抗组织滴虫药物，具有极强的抗组织滴虫作用。但是，如何在肉鸽养殖过程中合理使用DMZ并避免在产品中产生残留是广大养殖户亟需解决的问题。
本试验结合生产实际，采用饲喂和灌胃2种方式，在亲鸽哺育乳鸽的起始阶段给予亲鸽DMZ，用药时间均为连用5 d。由于饲料被亲鸽采食后要经过消化、吸收、分泌或与半消化饲料混合再哺育给乳鸽，所以乳鸽采食的鸽乳中的药物含量将显著降低。本试验结果显示，2种亲鸽给药方式都会引起乳鸽体内药物残留，但相同采样时间乳鸽各组织中的药物残留水平远低于亲鸽，这主要由于乳鸽采食的鸽乳中药物含量相对较低(最高10.96 μg/kg)。亲鸽组织DMZ及其代谢物的残留浓度和残留时间均高于乳鸽；
亲鸽饲喂给药建议休药时间为19 d，乳鸽为16 d，亲鸽灌胃给药建议休药时间为22 d，乳鸽为19 d。
本试验检测给药后1日龄乳鸽组织中DMZ及其代谢物的残留消除规律，其他日龄乳鸽的代谢规律是否相同仍需探讨。鸽乳由亲鸽嗉囊黏膜上皮细胞的脱落物和细胞碎片组成，乳鸽7日龄开始，鸽乳中逐渐包含了消化不完全的饲料颗粒，而中后期鸽乳中主要是亲鸽采食的饲料[19,20]。本试验鸽乳中DMZ及其代谢物残留消除规律表现为1日龄最高，然后逐渐下降至不能检出，这与鸽乳中亲鸽嗉囊黏膜上皮细胞脱落物和细胞碎片的比例变化成正相关；
7日龄后鸽乳中基本无DMZ及其代谢物检出。因此，如果调整给药日龄，避开0～7日龄给药，鸽乳中DMZ及其代谢物残留可能会显著减少，从而进一步减少和缩短乳鸽体内的药物残留时间，但此推断还需要进一步试验验证。
