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王道滇，魏光强，杨彩艳，黄艾祥
（云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201）
乳饼是滇中彝族、路南撒尼族地区的一种传统酸凝新鲜奶酪，乳饼中较高的蛋白质含量是生物活性肽的重要来源[1-2]。牛乳蛋白经内源性乳蛋白酶、微生物发酵或者消化酶酶解、酸水解后能产生具有多种生物功能属性的衍生肽[3]，例如：阿片肽、抗氧化肽、免疫调节肽、抗菌肽、抗高血压肽和酪蛋白磷酸肽等[4-5]。研究表明贯筋藤凝乳酶加工的乳饼蛋白肽具有一定的体外抗氧化活性和抑菌活性[6-7]；
锡金chhurpi奶酪经过体外模拟消化后具有较高的抗氧化活性和ACE抑制活性[8]。
乳源生物活性肽具有安全性高、活性强等优点，但作为蛋白质的降解产物，活性肽在加工贮藏过程中会发生水解、氧化、脱酰胺、环化等生化反应，导致其空间结构以及肽链结构遭到破坏，使其活性降低甚至完全丧失[9-10]。此外，消化过程中的胃蛋白酶和胰蛋白酶在一定程度上会降解活性肽，影响其活性稳定性。植物源抗氧化肽大豆[11]、玉米[12]、小麦[13]、菜籽[14]以及杏鲍菇柄抗氧化肽[15]，和动物源抗氧化肽鸭肉[16]、羊乳[17]、大黄鱼内脏抗氧化肽[18]的抗氧化活性均受加工条件（温度、p H值、压力以及食品原辅料）和消化的影响。因此，保证活性肽能有效发挥生物活性作用的前提是活性肽要具有良好的稳定性。但目前对乳饼源抗氧化肽的活性及其稳定性鲜见报道，其活性稳定性尚不明确，因此，开展对乳饼源抗氧化肽活性稳定的研究尤为重要。
课题组前期通过添加乳酸菌发酵酸化，辅助加热凝乳，研发了发酵型乳饼，研究了传统乳饼（TRB）和发酵乳饼（FRB）水溶性肽的抗氧化活性，得出分子量3～10 ku和＜3 ku的乳饼蛋白肽组分抗氧化活性较高[1]，然而这两部分粗肽的抗氧化稳定性有待研究。对此，本研究将通过超滤分离得到分子量3～10 ku和＜3 ku的TRB和FRB蛋白肽组分；
以自由基清除率、还原能力RP为指标，探究温度、p H、压力、食品原辅料以及模拟胃肠消化对TRB和FRB蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响。研究旨在表征乳饼源活性肽的活性稳定性，为乳饼及其蛋白肽制品的加工生产、贮藏提供理论指导。
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料
荷斯坦牛奶：由云南德摩菲尔生物科技有限公司提供。
自然发酵酸乳清：加工乳扇、乳饼剩余的乳清装于密闭的玻璃罐中，在自然条件下发酵15～20 d而成，p H在3.0～3.2之间。
实验菌株：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）为CICC菌株；
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)从用于生产乳扇、乳饼的酸乳清中分离鉴定，4株菌活化至活菌数＞108cfu/m L时按体积比为1∶1∶2∶2复配，菌液经离心后除去上清液，并用PBS缓冲液冲洗，加入冻干保护剂后进行冷冻干燥制得直投式发酵剂（活力为2.6×107cfu/g）。
1.1.2 主要试剂
胃蛋白酶（695 U/mg）、胰蛋白酶（8×USP）、胰凝乳蛋白酶（1500 U/mg）、胆汁盐，美国sigma公司；
2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH），天津化学有限公司；
2,2"-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS），上海晶纯生化科技股份有限公司；
HCl、NaOH、NaCl均为分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.2 仪器与设备
URA14M 0018紫外分光光度计，上海翱艺仪器有限公司；
SCIENTZ-18N真空冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司；
Merck Millipore（膜片直径76 mm）超滤杯，上海轩仪仪器设备有效公司；
HPP.L1-600/5超高压设备，天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 乳饼的制备和水溶性肽样品的提取
根据我们之前的研究方法制备乳饼和不同分子量蛋白肽粗取物[1]。具体工艺如下：
传统酸水乳饼加工工艺：新鲜牛奶→杀菌（85℃，15 min）→添加自然发酵酸乳清（按牛奶∶酸乳清=6∶1比例添加酸乳清）→调整pH至4.8→凝乳（85～90℃，5 min）→形成凝乳颗粒→过滤→压制成型→传统酸水乳饼。
发酵型乳饼加工工艺：新鲜牛奶→杀菌（85℃，15 min）→冷却（38～42℃）→接种发酵剂（质量分数0.2%～0.3%）→发酵（42℃，发酵至终点pH为4.9）→升温凝乳（65℃，30 min）→形成凝乳块→过滤→压制成型→发酵型乳饼。
乳饼样品切碎→按料液（水）比为1∶15进行混合→均质分离（8 000 r/min，5 min）→超声提取（超声功率360 W、超声时间30 min）→离心（离心力9 000 r/min、温度4℃、时间20 min）→取上清液→超滤（0.3 MPa，过10、3 ku的超滤膜，得到分子量3～10 ku和＜3 ku的分离组分）→冷冻干燥（5～10 MPa，-50℃）→乳饼蛋白肽冻干粉，于-80℃冰箱保存备用。
1.3.2 乳饼蛋白肽的抗氧化活性测定
参考Liu J等[19]的方法测定ABTS自由基清除能力；
参考Gecibesler,等[20]的方法测定DPPH自由基清除能力；
根据S Lin等[21]的方法测定还原能力RP。
1.3.3 温度对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
配制质量浓度为10 mg/mL的TRB和FRB蛋白肽超滤组分溶液，分别在25（室温）、40、60、80、100℃条件下保温2 h，保温完成后急速冷却至室温，评价其体外抗氧化活性的变化。
1.3.4 p H值对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
配制质量浓度为10 mg/mL的TRB和FRB蛋白肽超滤组分溶液，用1 mol/L盐酸和氢氧化钠调整溶液p H分别为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室温震荡反应2 h，结束后调节样品的p H为7.0，评价其体外抗氧化活性的变化。
1.3.5 食品原辅料对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
1.3.5.1 NaCl和蔗糖质量分数对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
配制质量浓度为10 mg/m L的TRB和FRB蛋白肽超滤组分溶液，分别添加质量分数2%、4%、6%、8%、10%、12%的蔗糖和NaCl，室温震荡2 h后，评价其体外抗氧化活性的变化。
1.3.5.2 山梨酸钾质量分数对乳饼蛋白肽的抗氧化活性稳定性的影响
配制质量浓度为10 mg/mL的TRB和FRB蛋白肽超滤组分溶液，分别添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的山梨酸钾，室温震荡2 h后，评价其体外抗氧化活性的变化。
1.3.6 压力对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
配制质量浓度为10 mg/mL的TRB和FRB蛋白肽超滤组分溶液，在100～600 MPa下处理10 min，评价其体外抗氧化活性的变化。
1.3.7 体外模拟消化对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
参照Carriotti[22]和Monsoor[23]的方法略作修改。模拟胃消化：准确称取1 g分子量＜3 ku和3～10 ku的FRB和TRB蛋白肽冻干粉溶解于20 mL去离子水中，并用HCl（0.5 mol/L）调节pH至2，然后加入胃蛋白酶（m酶∶m蛋白质=1∶100），在37℃条件下震荡消化2 h，消化结束后通过在95℃下加热溶液15 min来进行灭酶处理。模拟胰消化：将灭酶后的胃消化物用NaOH（1 mol/L）调节p H至7.5，然后加入胰酶，胰凝乳蛋白酶和胆汁盐（m酶∶m蛋白质=1∶100），在37℃条件下震荡消化2 h，然后在沸水中加热15 min终止反应。最后将混合物于4℃，4 000 r/min离心10 min，取出上清液，测定其体外抗氧化活性的变化。
1.3.8 数据处理及统计分析
所有数据均做3次平行实验，使用SPSS 19.0统计软件进行分析处理，处理结果以平均数±标准差表示，P＜0.05，差异显著。采用Microsoft Excel 2007和Origin 2019b进行图表绘制。
2.1 温度对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
如图1（a）、1（b）所示，分子量＜3 ku、3～10 ku的FRB和TRB蛋白肽ABTS·清除率和DPPH·清除率随着温度的逐渐升高呈下降趋势，DPPH·清除率受温度影响更显著（P<0.05）。分子质量＜3 ku、3～10 ku的FRB蛋白肽ABTS·清除率保持在35%以上，3～10 ku的FRB蛋白肽DPPH·清除率保持在80%以上，不同分子量的FRB蛋白肽DPPH·清除率均高于TRB。如图1（c）所示，当温度为40℃时分子质量＜3 ku的FRB乳饼蛋白肽和分子质量为3～10 ku的FRB和TRB蛋白肽还原能力RP较强，分子质量为＜3 ku的TRB蛋白肽在25～80℃时，还原能力RP逐渐增大，100℃时略有下降，但还原能力RP仍高于25℃时。完整的二级结构对维持肽的生物活性十分重要，处理温度过高、加热时间长不可避免地会改变抗氧化肽的二级结构[24-25]，影响其稳定性，此外，长时间的热处理可促进具有清除自由基能力的疏水氨基酸间的相互作用，从而导致抗氧化活性降低。因此，FRB和TRB蛋白肽的抗氧化活性受高温影响较大，乳饼及其抗氧化肽适宜在中低温环境中加工和保藏。
图1 温度对乳饼蛋白肽超滤组分体外抗氧化活性的影响
2.2 pH值对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
如图2所示，p H值对乳饼蛋白肽的抗氧化活性稳定性影响较大，FRB蛋白肽抗氧化活性稳定性高于TRB，当环境p H值接近中性时，乳饼蛋白肽抗氧化活性最高，其中3～10 ku的FRB蛋白肽ABTS·清除率达51.88%，DPPH·清除率为95.15%，还原能力RP值为0.42。当环境p H值偏离中性时抗氧化活性开始下降，特别是环境p H值较高时清除率显著下降，较高和较低的pH值导致还原能力RP值急剧降低（除TRB分子质量＜3 ku），因此，乳饼蛋白肽的ABTS·清除率和DPPH·清除活性对碱性环境更敏感，ABTS·清除活性对酸性不敏感。原因是酸碱度修饰会引起肽的物理化学变化，肽可能发生电离状态的变化、非特异性切割和氨基酸损伤以及部分肽水解而导致抗氧化能力的下降[26-27]，碱性环境中肽易发生水解和消旋作用，从而容易影响肽的活性[28]，而酸性则会降低分子溶解度，影响肽分子羟基的有效性，这有可能促进氢原子的捐赠，减弱DPPH·清除活性[29]。乳饼蛋白肽耐酸、碱性较弱，为了保持较好的抗氧化活性，宜在中性、弱酸性环境中加工制备和保藏乳饼。
图2 pH值对乳饼蛋白肽超滤组分体外抗氧化活性的影响
2.3 NaCl质量分数对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
如图3所示，当环境中NaCl质量分数在2%～10%时，随着环境NaCl质量分数的提升，FRB和TRB蛋白肽的ABTS·清除率和DPPH·清除率逐渐提升，当环境NaCl质量分数超过10%时，自由基清除率略有下降，环境NaCl质量分数为12%时，ABTS·清除率均高于20%，DPPH·清除率均高于35%。还原能力RP的变化趋势和ABTS·清除率和DPPH·清除率相似，但当环境NaCl质量分数超过8%时，还原能力开始下降，NaCl质量分数为12%时，还原能力均高于0.25。研究表明，肽与含有NaCl的食品基质之间的相互作用有利于肽生物活性的维持[29]。综上，2%～8%的NaCl有利于乳饼抗氧化肽活性的提高；
为改善乳制品口感的或时保证其抗氧化肽较高的活性，在加工和应用过程中可适量添加食盐。
图3 NaCl质量分数对乳饼蛋白肽超滤组分体外抗氧化活性的影响
2.4 蔗糖质量分数对乳饼蛋白肽的抗氧化活性的稳定性的影响
由图4可知，当环境中蔗糖质量分数在2%～12%时，TRB和FRB蛋白肽抗氧化活性值随着蔗糖添加量的上升呈现缓慢下降趋势，与刘晓艺等[30]研究结果一致。还原糖类与蛋白水解产物多肽发生美拉德反应时，生成的还原性物质具有更强的提供质子能力，这可能对增加多肽的抗氧化活性有利。但乳饼蛋白肽溶液中添加蔗糖后，体外抗氧化活性缓慢下降，原因可能是大分子蔗糖常温下无法水解为还原糖。因此，蔗糖与乳饼蛋白肽无法发生美拉德反应从而阻止了因还原糖与肽或氨基酸的交联而使肽活性发生变化，因而蔗糖对抗氧化活性没有明显影响[31-32]。
图4 蔗糖质量分数对乳饼蛋白肽超滤组分体外抗氧化活性的影响
2.5 山梨酸钾质量分数对乳饼蛋白肽的抗氧化活性的稳定性的影响
山梨酸钾作为化学防腐剂可用于奶酪制品的保鲜贮藏中[33]。由图5可看出，随着山梨酸钾添加量的改变，乳饼蛋白肽抗氧化活性值呈无规律的波动，变化均不显著（P＞0.05），FRB抗氧化活性高于TRB，其超滤组分自由基清除率保持在85%左右，还原能力RP保持在0.22～0.35。因此，在国标规定限量范围内使用山梨酸钾对乳饼蛋白肽抗氧化活性影响不显著，与郑志强研究结果一致[13]。
图5 山梨酸钾质量分数对乳饼蛋白肽超滤组分体外抗氧化活性的影响
2.6 压力对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
超高压加工技术在食品工业中的应用日益广泛，超高压加工技术有助于氨基酸残基的化学变化，从而导致蛋白质结构和功能特性的改变，而在超高压下和低温条件下微生物受到抑制，而食品的天然风味和营养价值不受影响。如图6所示，乳饼蛋白肽各分离组分都具有优异的耐压性，FRB蛋白肽抗氧化活性高于TRB。乳饼蛋白肽的DPPH·清除率高于80%（＜3 ku的TRB除外），还原能力RP高于0.28（＜3 ku的TRB除外）；
FRB蛋白肽的ABTS·清除率高于32.47%。结果表明在短时间内（10 min）高压处理可以保持较好的结构和抗氧化活性。通常，超高压会改变蛋白质的表面结构和聚集状态，此外，如果活性位点中的键发生变化，蛋白质也将失去其活性。大部分的酶活性会被超高压处理降低，而有些则会因为催化机制不同而增加，张艺峰等[34]研究表明超高压处理能提升鳕鱼蛋白的ACE抑制活性；
Sana Gammoh等[35]研究表明超声处理可以增强骆驼发酵乳的抗氧化活性和ACE抑制活性。因此，乳饼蛋白肽的抗氧化活性对超高压加工技术有较好的适应性，在后续的加工中可采用超高压冷杀菌技术，在保障产品质量和风味的同时提升其生物学价值。
图6 压力对乳饼蛋白肽超滤组分体外抗氧化活性的影响
2.7 体外模拟胃肠道消化对乳饼蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
如图7所示，FRB和TRB蛋白肽DPPH·清除率随着胃蛋白酶的消化缓慢下降，当胃消化时间到达2 h时，清除率分别为：（56.634±1.483）%、（63.430±2.021）%、（54.693±3.121）%、（62.136±1.942）%；
在第二阶段模拟肠道消化过程中，乳饼蛋白肽的DPPH·清除率急剧下降，当胰蛋白酶消化时间达2 h时，分子质量小于3 ku、3～10 ku的FRB和TRB蛋白肽的和DPPH·清除率分别为：（23.301±2.913）%、（29.773±1.483）%、（18.770±1.121）%和（26.861±2.021）%。You Lijun等[36]研究模拟胃肠道消化中泥鳅多肽清除DPPH·清除能力在胃中没有显著变化，在肠道中显著下降，与本研究结果一致。DPPH是一种油溶性的自由基，这就使得消化产物与DPPH·能够更好地接触反应，从而获得较高的DPPH·清除率；
当进入模拟肠道消化阶段，更多的游离氨基酸和小肽的生成导致消化产物的亲水性提升，不同分子质量抗氧化肽模拟消化产物极性的增加使得它更难捕获脂溶性的DPPH·从而降低了DPPH·清除率[37]。ABTS·清除率和还原能力RP随着酶的消化逐渐提高，当酶解时间为4 h时分子质量小于3 ku、3～10 ku的FRB和TRB蛋白肽的ABTS·清除率分别提升至：（41.858±0.269）%、（44.268±0.636）%、（46.855±1.134）%和（44.092±0.982）%，可能是因为乳饼蛋白肽模拟胃肠道消化后产生具有较强的自由基清除能力的氨基酸，如组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸[38]；
还原能力RP分别提升至：0.128±0.004、0.139±0.004、0.144±0.002和0.140±0.002，这与Liu D等[39]对鸭肉粗提物经过模拟胃肠消化后其还原力大大增加的研究结果相似。
图7 体外模拟胃肠消化对乳饼蛋白肽超滤组分体外抗氧化活性的影响
综合上述实验可知，环境温度、p H值对乳饼蛋白肽抗氧化活性影响较大，超高压、食品原辅料对抗氧化活性影响不显著，相同分子量的FRB蛋白肽在不同的加工条件和食品原辅料下始终表现出更高的体外抗氧化活性。
研究了不同分子量（3～10 ku和＜3 ku）传统乳饼（TRB）和发酵型乳饼（FRB）蛋白肽抗氧化活性在不同温度、p H值、食品原辅料、压力和胃肠消化过程中的稳定性。结果表明，高温和酸碱性环境中TRB和FRB蛋白肽抗氧化活性显著下降（P<0.05）；
乳饼蛋白肽抗氧化活性对压力有较好的适应性；
高糖抑制抗氧化活性（P＞0.05）。2%～8%的NaCl有利于提高抗氧化活性；
山梨酸钾添加量在国标允许范围内时对抗氧化活性影响不明显。经模拟胃肠道消化结束后，DPPH·清除活性显著降低（P<0.05）；
ABTS·清除活性、还原能力显著升高（P<0.05）。本文研究得出不同分子量发酵型乳饼（FRB）抗氧化肽活性稳定性高于传统酸水乳饼（TRB），且分子量3～10 ku的FRB抗氧化肽在不同加工条件及模拟胃肠消化环境下活性最好。后续可对3～10 ku的FRB蛋白肽进一步纯化，研究体内活性发挥效果，为新型乳饼抗氧化肽功能性产品的开发提供理论依据，促进乳饼及其蛋白肽产业的经济与发展。
