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李冰茹,高 冲,李 杨,高 媛,赵 芳,何昭颖,王北洪*
(1.北京市农林科学院质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室，北京 100097;2.北京市顺义区园林绿化局，北京 100097)
三七作为广泛应用的中药，含有脂肪、蛋白质、糖类、纤维等大分子以及氯、钠、氟、氯等元素的阴阳离子，其中氯离子的含量与药物疗效和人体健康有密切的关系[1]。离子色谱法在检测阴离子时具有快速、灵敏、选择性好等优点[2-4]，但受样品前处理的影响较大[5-6]。植物样品成分复杂，含有盐、酸、蛋白质等物质[7]，前处理方法的选择尤为重要[7-9]。在检测植物样品中氯离子的前处理方法中，高温干法灰化法应用较多[10]。此方法制备的待测液无杂色，但所需时间较长、耗能大、成本高、精密度低、可靠性也较差。氯离子能较快穿过植物的原生质膜[11]，因此可以采取水浴法直接提取三七样品中的氯离子。但该方法在提取氯离子时还会提取样品中的色素、糖、蛋白质等可溶性有机物，这不仅会影响检测结果的准确度，还会缩短色谱柱的使用寿命[12-13]。部分学者尝试在提取后采用活性炭[14]或固相萃取柱[15]净化提取液，虽然净化效果较好，但是试验成本较高。为此，本工作采用水浴法提取，正己烷净化，离子色谱法测定三七中氯离子的含量，以期为三七中氯离子的快速、经济、准确检测提供方法参考。
1.1 仪器与试剂
DIONEX ICS-2100 型离子色谱仪，配AS-DV型全自动进样器、Dionex AERS 500型电化学自动再生抑制器、氢氧化钾淋洗液自动发生器;3K30型离心机;MQS-30型水浴摇床;SX2-12TP型马弗炉;BS-200型电子天平;MY 型纯水系统。
氯离子标准溶液:1 000 mg·L－1。
氯离子标准储备溶液:取1 000 mg·L－1氯离子标准溶液1 mL，用水定容至100 mL 容量瓶中，配制成10.0 mg·L－1的氯离子标准储备溶液。
氯离子标准溶液系列:取适量氯离子标准储备溶液，用水逐级稀释，配制成质量浓度分别为0，0.05，2.00，5.00，10.00，20.00 mg·L－1的氯离子标准溶液系列。
正己烷为色谱纯;氢氧化钠为优级纯;0.22μm水相滤膜;试验用水为超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm。试验所用试剂和耗材均不得析出氯离子。三七样品采自三七种植基地。
1.2 仪器工作条件
IonPac AS15色谱柱(250 mm×4 mm，5μm);柱温30 ℃;淋洗液为30 mmol·L－1氢氧化钾溶液;等度洗脱;流量1.0 mL·min－1;电导抑制检测器电流120 m A;全自动进样，进样量25μL;采集时间15 min。
1.3 试验方法
新鲜三七样品经水冲洗干净后，于80 ℃杀青、烘干、粉碎、过筛(筛网孔 径0.28 mm)。称取2.000 0 g样品于50 mL离心管中，加入水40 mL，于90 ℃水浴提取60 min，冷却至室温。用水稀释至50 mL，以10 000 r·min－1转速离心3 min。分取上清液8 mL，置于10 mL 离心管中，加入2 mL正己烷，涡旋1 min，以6 000 r·min－1转速离心3 min。吸取下层水相，过0.22μm 水相滤膜，滤液供离子色谱分析。随同做空白试验。
2.1 色谱条件的选择
2.1.1 色谱柱
试验比较了规格相同的IonPac AS11、IonPac AS11-HC、IonPac AS15、IonPac AS19 等4 种色谱柱的分离效果。结果显示，以这几种色谱柱分析样品溶液时，氯离子灵敏度均较高，色谱峰都比较尖锐，其中IonPac AS15色谱柱对氯离子和共存组分的分离效果相对较好，这是由于IonPac AS15色谱柱是强亲水性、高柱容量色谱柱，对复杂基质中有机酸和阴离子具有较好的保留作用。因此，试验选择以IonPac AS15色谱柱进行分离。
2.1.2 淋洗液
在用离子色谱法分析时，淋洗液中的离子和样品溶液中的离子会对交换树脂的有效容量进行竞争，从而达到分离的目的。为了使竞争有效，淋洗液中的离子应和样品溶液中的有相近的亲和力[3]。常用的淋洗液有碳酸盐缓冲溶液、氢氧化钾溶液等。较低质量浓度的碳酸盐缓冲溶液不仅可同时洗脱一价和多价离子，还可通过调节碳酸根和碳酸氢根的质量浓度来降低由样品溶液注入带来的酸度变化[16]。但是，碳酸盐缓冲溶液在使用前需要进行脱气处理，耗时较长[17];碳酸根和碳酸氢根本身会电离，背景电导较高，影响检测结果的灵敏度[18]。氢氧化钾溶液具有背景电导低、噪声小、灵敏度高、无水负峰[19]等优点，但是该淋洗液易吸收空气中的二氧化碳，引起淋洗液电导变化，产生基线漂移，而空气中的二氧化碳可通过氢氧化钾淋洗液自动发生器除去，因此试验选择的淋洗液为氢氧化钾溶液。
2.1.3 淋洗液浓度
选择20，30，45 mmol·L－1氢氧化钾溶液进行等度洗脱。结果显示:当氢氧化钾溶液的浓度为20 mmol·L－1时，氯离子和氟离子分离效果较好，但硫酸根、磷酸根等离子不能被完全洗脱，影响色谱柱寿命;当氢氧化钾溶液的浓度为45 mmol·L－1时，氟离子和氯离子的保留时间比较接近，会对氯离子的准确测定造成干扰;当氢氧化钾溶液的浓度为30 mmol·L－1时，不仅氯离子和氟离子的分离效果较好，而且硫酸根、磷酸根可被完全洗脱。因此，试验选择氢氧化钾溶液的浓度为30 mmol·L－1。
2.1.4 淋洗液流量
设置淋洗液 流量分别为0.8，1.0，1.2 mL·min－1，比较了不同流量下样品中氯离子的分离效果。结果显示:当淋洗液的流量为1.2 mL·min－1时，氯离子和氟离子的保留时间比较接近，会对氯离子的准确测定造成干扰，同时流量较大时，系统压力增大，不仅易造成色谱柱塌陷，影响色谱柱的使用寿命，还易造成色谱系统漏液，不利于整个色谱系统的稳定运行[20];当淋洗液流量为0.8，1.0 mL·min－1时，氯离子和氟离子均可得到有效分离，但流量为0.8 mL·min－1时分析时间较长。因此，试验选择的淋洗液流量为1.0 mL·min－1。
2.2 提取条件的选择
2.2.1 提取剂
酸溶液和碱溶液均会引入杂质[21-22]，干扰氯离子的准确测定，因此试验选择以水直接提取氯离子。
2.2.2 水浴温度
分别在水浴温度为60，70，80，90，100℃时处理标准物质GBW 10043(辽宁大米)各60 min，氯离子的回收率见图1。
由图1可知，氯离子回收率随着水浴温度的升高而逐渐增加，当水浴温度不小于80 ℃时，回收率较大并趋于稳定。鉴于高温有利于析出蛋白质，因此试验选择的水浴温度为90 ℃。
图1 不同水浴温度下的回收率Fig.1 Recoveries with different water bath temperatures
2.2.3 提取时间
在水浴温度为90℃时分别处理标准物质GBW 10043(辽宁大米)30，45，60，90，120 min，氯离子回收率见图2。
图2 不同提取时间下的回收率Fig.2 Recoveries with different extraction time
由图2可知，氯离子回收率随着提取时间的延长而逐渐增加，当提取时间不小于60 min时，回收率较大并趋于稳定。因此，试验选择的提取时间为60 min。
2.3 净化条件的选择
2.3.1 净化方式
样品提取液经离心后，上清液分别采取正己烷和C18固相萃取柱净化。结果显示:二者净化液的色谱图(图3)基本一致;氯离子测定值分别为663.5，664.1 mg·kg－1，测定值的相对标准偏差(RSD，n＝6)分别为1.4%和2.0%。考虑到正己烷的使用成本远远低于C18固相萃取柱，且操作简单、快速，因此试验选择正己烷净化样品提取液。
图3 以正己烷和C18固相萃取柱净化时的色谱图Fig.3 Chromatograms after purification with n-hexane and C18 solid phase extraction column
2.3.2 净化剂用量
当分取的上清液为4 mL 时，设置正己烷和上清液的体积比分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，比较了不同用量正己烷净化样品的效果。结果显示，和其他体积比下的净化效果相比，当正己烷和上清液体积比为1∶4时，氯离子色谱峰附近杂峰较少，色谱峰的响应值也较高，因此试验选择的正己烷和提取液的体积比为1∶4。
2.4 标准曲线和检出限
以氯离子的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示，氯离子标准曲线的线性范围为0.05～20.00 mg·L－1，线性回归方程为y＝0.357 1x＋0.137 1，相关系数为0.999 9。
按照HJ/T 91－2012《地表水和污水监测技术规范》的规定，对样品空白进行20 次重复测定，以3倍标准偏差(s)计算检出限(3s)，结果为0.005 mg·L－1。
2.5 精密度和准确度试验
按照试验方法分析实际样品1，测定值为663.5 mg·kg－1，对该样品进行3个浓度水平(加标量分别为10，50，100 mg·kg－1)的加标回收试验，每个浓度水平平行测定6次，计算回收率和测定值的RSD。结果显示，氯离子的回收率为85.4%～105%，测定值的RSD 为2.8%～4.2%，说明方法的准确度和精密度较好。
由于缺乏三七基质的标准物质，按照试验方法分析其他标准物质GBW 10043(辽宁大米)和GBW 10044(四川大米)，所得测定值分别为380.2，282.0 mg·kg－1，和认定值(380，280 mg·kg－1)基本一致，进一步说明方法的准确度较好。
2.6 方法比对
按照试验方法分析实际样品2，并和文献[10]采用的高温干法灰化法所得的结果进行比对。结果显示:测定值分别为884.7，883.1 mg·kg－1，两种方法的测定值基本一致;测定值的RSD(n＝6)分别为1.5%，3.3%，说明本方法的精密度优于高温干法灰化法的。
本工作采用水浴法提取三七样品中氯离子，在IonPac AS15(250 mm×4 mm，5μm)色谱柱上用30.0 mmol·L－1氢氧化钾溶液以1.0 mL·min－1流量等度洗脱，方法具有成本低、用时短且操作简单等优点，可为三七样品中氯离子的质量控制提供有效的技术参考。
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