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徐雪莹，王岳恒
微泡（microbubbles，MB）是一种直径在2 ～8 μm的超声造影剂[1]。
MB 能够通过直接相连法、非共价结合法等方法连接特定的配体从而成为功能化的靶向微泡（targeted microbubbles，tMB）[2]。
tMB 可以与疾病发生、发展过程中表达的特定分子相结合，尤其是内皮细胞表达的生物标志物[3]。
从而能够监测疾病的发生、发展过程。近年来，国内外学者研发出了各种各样tMB，许多实验结果证实tMB 在疾病的诊疗方面有显著优势，且目前载有抗血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的tMB 也已经开始用于前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等的临床研究[4]。
目前，概括来说tMB 主要应用于超声分子成像（ultrasound molecular imaging，UMI）和疾病靶向治疗领域。
笔者将重点阐述tMB 的分类与制备和在UMI 领域及疾病治疗领域的最新研究进展。
传统制备tMB 方式是将单一抗体或小肽连接到脂质外壳上， 最近用新的制备工艺研发出了新的tMB，如磁化tMB、黏附多个配体tMB 及黏附新型配体的tMB。将磁性纳米颗粒添加到MB 的脂质外壳中即能产生磁化tMB[5]。
磁化tMB 由于含有磁性纳米颗粒，在磁场具有磁感应性加热特征，可对靶区肿瘤实现热疗。有研究数据表明，在胰腺癌小鼠模型中，使用磁化tMB 明显提高了肿瘤的治疗效果[6]。
黏附多个配体的tMB 相较于黏附单个配体的tMB， 具有更好的靶向性。
例如在小鼠肝细胞癌肿瘤模型中，与仅装置VEGFR2 抗体，或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（arginine-glycine-aspartate，RGD）的tMB 相比，同时装置VEGFR2 抗体和RGD 肽的tMB 在超声下所显示的肝癌信号强度明显更高[7]。此外，同时携带抗血管细胞黏 附 分 子1 （vascular cell adhesion molecule -1，VCAM-1）、 抗细胞间黏附分子1 （intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1） 和抗合成聚合物唾液酰LewisX 的三重tMB 比单tMB 能更有效地黏附于小鼠脑微血管内皮细胞3 （brain-derived endothelial cells 3，bEnd.3） 和能更好地监测动脉粥样硬化的演变过程，以及能够更精准评估阿托伐他汀对小鼠动脉粥样硬化模型的治疗效果[8]。
随着已知生物标志物和新配体的种类、数量越来越多，新研发的tMB 随之而来。例如对于诊断性UMI，研究表明，使用胸腺细胞分化抗原1（mocyte differentiation antigen 1，thy1）结合的单链抗体作为tMB 的配体，可以用于荷瘤小鼠胰腺导管腺癌诊断[9]，含抗轴突导向因子1（Netrin-1）的tMB，可用于乳腺癌的诊断[10]。一种携带小于目前常用抗体尺寸的配体，即携带B7-H3（属于B7 配体家族成员，在多数癌症类型中都过度表达）抗体的tMB，可用于原位人乳腺癌和转基因乳腺癌小鼠模型中UMI[11]。
此外，附着基质金属蛋白酶1 抗体（anti-matrix metalloppoteinase-1，anti-MMP-1）的tMB 可用于小鼠喉鳞状细胞癌早期诊断[12]。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican，GPC3）的功能化tMB可用于小鼠肝细胞癌靶向超声动力学治疗[13]。
一项研究发现，使用基于二硬脂酰基磷脂酰胆碱（disaturated phosphatidylcholine，DSPC） 的MB 先与抗CD4 偶联，然后结合CD4 阳性淋巴细胞， 可以监测大鼠同种异体心脏移植物是否发生急性排斥反应[14]。
此外，为了使得tMB 能够应用于临床，必须使用一种生物素-链霉亲和素偶联的方法将配体与MB 结合，以避免机体出现免疫反应。例如在制备携带P-选择素和E-选择素的tMB，一种策略是使用一种基于T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白1 （T-cell immunoglobulin mucin family member 1，TIM-1） 的重组蛋白与硫醚键共价偶联，另一种策略是将配体与MB外壳中的马来酰亚胺基团的化学偶联[15]。而且，新开发的菌株促进的[3+2]氮炔环加成（strain-promoted[3+2]azide-alkynecycloaddition，SPAAC）可用于MB 形成后的配体无菌偶联过程[16]。
此外，用乳酸黏附素修饰后的士卓安 （Sonazoid） 造影剂制备的αvβ3 整合素（是细胞黏附家族的重要成员， 在多种肿瘤细胞表面及新生血管内皮中高表达）的tMB 也可避免机体出现免疫反应。
但是目前上述tMB 制备方法及对超声反应的描述并不系统全面， 这阻碍了tMB 快速发展及向临床转化的进程， 未来应对tMB 的制备工艺及超声反应进行系统描述。
UMI 主要用于研究疾病进展、诊断成像和监测治疗反应，常用于心血管疾病、肿瘤等领域。在心血管疾病方面，P-选择素、VCAM-1、血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）和基质细胞衍生因子1（stromal-derived-factor-1，SDF-1）等因子是监测动脉粥样硬化炎症反应的常用靶点[17]。
如P-选择素-tMB 可用于评估大鼠心房颤动模型的血栓形成的风险，并与白细胞-tMB 和CD4-淋巴细胞-tMB 一起，可以在自身免疫性心肌炎小鼠模型中预测是否会发生心室纤维化和重构[18]。
在肿瘤方面，Netrin-1-tMB 用于小鼠乳腺癌中Netrin-1 阳性表达程度的检测， 这为是否开始Netrin-1 干扰治疗提供重要的诊断信息。B7-H3-tMB的UMI 可以在乳腺癌小鼠模型中区分转移性和反应性前哨淋巴结[19]，并且以P-选择素和αvβ3 整合素为靶点的双靶向tMB 在肿瘤转移淋巴结中的信号强度明显高于良性淋巴结。因此也可以用于区分良性和转移性淋巴结[20]。
另外，UMI 还适用于监测肿瘤抗血管生成的治疗效果，如舒尼替尼和贝伐珠单抗对血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR） 表达的抑制作用可以用UMI 进行较精准的监测。此外，目前VEGFR2-tMB 的制备工艺较成熟，可用于跟踪结肠癌、乳腺癌和透明细胞性肾细胞癌等肿瘤模型的疾病进展和治疗反应[21，22]，且VEGFR2-tMB（即BR55）已经完成了Ⅱa 临床试验，BR55投入临床，大规模造福病人指日可待。
但是在UMI 被转化到临床之前还必须证明每个分子靶点的临床相关性。有学者使用体外高危和低风险的人类颈动脉斑块进行鉴定的方法筛选出了动脉粥样硬化中高危颈动脉斑块的生物标志物，如VCAM-1、氧化低密度脂蛋白受体（lectin like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1）、P-选择素和VWF。且研究发现VCAM-1-tMB 在体外血流下与人主动脉内皮结合最好[23]。
在肿瘤方面，VEGFR1 在眼部黑色素瘤小鼠模型中被验证为良好的血管模拟的生物标志物[24]。
未来，将对面向临床转化的tMB 的配体进行更严格的筛选。
无论是在心血管疾病治疗领域还是在肿瘤治疗方面，tMB 的治疗效果都明显优于非tMB[25~27]。
在心血管疾病治疗领域， 静脉注射磁化tMB 或附着有ICAM-1 或P-选择素抗体的tMB 治疗效果都显著优于普通非tMB。
如体内大鼠血栓模型中，同时使用磁化tMB 和重组人组织型纤溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）能增强凝块附近的空化能，从而增加溶栓效果[24]。负载白细胞介素8（interleukin-8，IL-8）-tMB 能稳定动脉粥样硬化斑块[28]。
在肿瘤领域，静脉注射附着有VEGFR2、αvβ3、CD13 或DLL4（Delta-like，一种膜结合的Notch 配体）抗体的tMB 或是以CD326 为靶点的tMB 显像和治疗效果也强于非tMB。例如超声介导的负载DLL4-tMB 增加了小鼠胃肿瘤的凋亡率[29]。
此外，Kang M 等[30]也证实携带环RGD 肽和趋化因子受体2[che-mokine（C-C motif）receptor 2，CCR2]抗体的双靶向阳离子tMB 的乳腺癌信号更强且治疗效果更好。
除此之外，学者们对超声联合tMB 治疗疾病的机制进行了深入研究，发现tMB 可以以多种方式增强局部药物传递， 这些治疗作用的机制尚不完全清楚，但已经阐述了多种药物传递的途径，如声孔效应、内吞作用和细胞间接触打开、细胞内钙离子流动等[31，32]。
另外，学者们还发现不同类型的配体可以通过不同的方式连接到MB 上，5-氟尿嘧啶和紫杉醇可以通过改变MB 外壳和结构的方式整合到MB 中[33]，DNA可以结合到脂质外壳的阳离子上[34]，抗体、脂质体、生物素化药物通过链霉亲和素-生物素桥接法与脂质外壳相连。
抗体也可充当媒介将MB 与干细胞偶联，如CD90 抗体可以充当桥梁作用将ICAM-1 抗体和MB连接到一起，从而可以靶向动脉粥样硬化斑块中内皮细胞，稳定小鼠体内动脉粥样硬化斑块[35]。
此外，配体也可以被合并到脂质体外壳后再通过链霉亲和素-生物素法连接到MB 上， 该策略制备tMB 的优势在于配体对脂质体的亲和力更好。
Zhao G 等[36]研究表明，在体内胶质瘤大鼠模型中， 一种含有短发夹RNA（short hairoin RNA，shRNA） 的CD13 靶向脂质体，可以打开血脑屏障 （blood brain barrier，BBB）， 增强shRNA 的传递，从而抑制肿瘤生长，延长存活时间。此外，学者们还对超声联合tMB 的治疗时间、超声频率等进行了深入研究。
发现研究采用的超声频率在0.25 ～4.00 MHz 不等。治疗的时间在一定周期内多次重复治疗不等， 每次治疗的时间也是1 ～20 min 不等。
未来， 随着对tMB 治疗作用的深入研究， 将使tMB 在肿瘤、心血管等疾病领域的治疗的作用达到最大化。
笔者强调了tMB 在超声分子成像和治疗中的不同用途和潜力，以及相较于非tMB,使用tMB 进行治疗的优势。
tMB 有时甚至可以用作治疗药物，这也是UMI 与治疗的结合。
同时在未来，tMB 仍有许多需要进一步完善的地方， 例如需要进一步阐明tMB 复杂的生物学机制及肿瘤细胞-药物相互作用的机制，以达到最大程度地发挥tMB 治疗疗效的目的。
随着新的tMB 不断开发， 推动tMB 的临床转化成为tMB 未来发展的核心问题。
此外，研究人员需要尽可能详细地阐述tMB 生产的方法，包括脂质材料的种类、摩尔比、使用的有机溶剂的类型等，因为以上各种方面都会对tMB 的大小、 稳定性等产生巨大的影响。
而且tMB 上配体的多样性使其进入临床的途径变得复杂，为了促进tMB 的广泛使用， 还需要就生产规范和临床使用标准达成共识。
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