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杨燕燕， 孙 宇， 吴春会， 李运起， 赵 超， 李秋凤， 王明亚
(河北农业大学动物科技学院， 河北 保定 071000)
苜蓿产量高，营养丰富，享有“牧草之王”的美誉，是反刍家畜粗饲料的重要来源之一[1]。为缓解一年四季中饲草供应不均衡的问题，苜蓿主要利用方式为调制成干草贮藏使用。已有研究表明现蕾期的苜蓿干草的粗蛋白含量在20%以上、胡萝卜素含量为140 mg·kg-1以上，粗纤维含量为30%以下[2]。干草捆因具有体积小和便于运输的优点，成为苜蓿干草运输贮藏的主要方式[3]。苜蓿干草捆的营养品质受调制过程的影响，调制过程中，苜蓿鲜草的干燥时间不够导致水分含量较高[4]，再加上苜蓿收获季节多为梅雨季，空气湿度较大[5]，霉菌大量繁殖，造成营养品质下降。此外，苜蓿草捆在收割时会携带田间真菌，且贮藏期间的干燥和性pH环境中也会使干草捆被霉菌污染[6]。同时，一些真菌物种可以产生大量的真菌孢子，这些真菌孢子就会通过空气在干草捆中传播[7]。霉菌大量增殖的代谢产物——霉菌毒素，会严重威胁到畜禽的机体健康与畜产品安全[8]。因此，在贮藏期间减少饲草霉变的发生，成为了亟待解决的难题。
干草防霉剂能有效减少贮藏期间霉菌的增殖，如有机酸及其盐类与生物制剂，其中柠檬酸能直接被生物体吸收代谢，且无残留、无抗药性、无毒副作用，其作为绿色添加剂在畜牧业已得到广泛应用。大量研究表明柠檬酸具有提高畜禽的生长性能、降低死亡率、提高免疫力，改善肠道健康、改善青贮的营养品质与发酵特性的功能[9-14]。此外，柠檬酸作为防霉剂已广泛被应用于食品添加中，不仅能调整食品的风味，还可以对某些微生物的生长起到良好的抑制作用，进而起到防止食品变质的作用[15-16]。畜牧业中也有研究证明在配合饲料中添加0.5%～5%的柠檬酸,能有效抑制微生物的增殖及毒素的产生，减少贮存期间营养品质的损失，从而保证饲料质量，减少浪费[17]。作用机理是其可以在饲料的表面形成一层均匀的有机酸的保护膜，且柠檬酸能显著降低饲料的pH值至霉菌无法增殖，从而达到抑菌的作用[18]。将4%的柠檬酸添加至乳酸菌发酵饲料中，与对照组相比，可减缓霉变情况的发生[19]。葛文霞[20]发现在TMR颗粒饲料中添加防霉剂的防霉效果为：2%柠檬酸>1%柠檬酸>0.5%柠檬酸。然而，关于柠檬酸在畜牧业的研究大多数是体内试验，很少有人研究柠檬酸在体外的防霉防腐效果。本研究通过在苜蓿干草中添加不同水平的柠檬酸，研究贮藏期间苜蓿干草的营养品质与霉菌数量的动态变化，探究其防霉效果及确定最佳用量，旨在探讨柠檬酸的体外防霉效果并以期提供理论依据。
1.1 试验材料
试验材料来自河北省沧州市海兴县2021年9月收获的第三茬‘中苜二号’紫花苜蓿(现蕾期，种植第三年)。
1.2 试验方法
试验采用单因素完全随机设计，试验处理分别为：CK，为不添加防霉剂处理；
N1为添加1%柠檬酸处理；
N2为添加2%柠檬酸处理；
N3添加3%柠檬酸处理，每个处理设置3个重复。用2.5 L喷壶将提前配制好的柠檬酸水溶液(将不同量的柠檬酸溶于同量的蒸馏水中)均匀喷施于翻晒后的草条上(草条厚度约为0.1 m，含水量为22%～25%)，自然晾晒3小时左右，至含水量20%时，通过打捆机(打捆机型号为：MASSEY FERGUSON 9YF-1.92(1 840))打成小方捆，草捆长0.8 m，宽0.35 m，高0.3 m，打捆密度为178 kg·m-3。将打捆后的苜蓿草捆中每3捆无规则地堆成草垛，放置于通风良好的草棚内贮藏。试验共分为四个处理组，贮藏期从2021年9月17日到2021年11月17日，贮藏20，30，40，50与60 d环境中的平均温度分别18.40℃，12.20℃，9.60℃，11.70℃与5.60℃；
相对湿度分别为85.81%，71.00%，75.60%，85.09%与62.00%，分别在贮藏的第0 d，20 d，30 d，40 d，50 d，60 d用电动取样器在草捆的4个面分上、中、下3层取样，每层取4个样，每个草捆的48个样混合均匀，带回实验室，取10 g用于测定霉菌数量，剩余部分测定常规营养指标。
1.3 试验指标及测定方法
1.3.1常规组分测定方法 饲料中水分测定采用GB/T6435-2014测定；
粗脂肪(EE)参照GB/T6433-2006进行测定；
粗蛋白(CP)参照GB/T6432-2018进行测定；
粗灰分(Ash)参照GB/T6438-2007测定；
中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)分别参照GB/T20806-2006、NY/T1459-2007用美国ANKOMA2000i全自动纤维仪进行测定；
可溶性糖(WSC)采用蒽酮-硫酸比色法测定。
相对饲喂价值(RFV)代表反刍动物对可消化干物质(DDM)的随意采食量(DMI)，DDM和DMI通过粗饲料的NDF和ADF值计算。计算公式如下：
RFV=DMI×DDM/1.29
DMI=120/NDF
DDM=88.9-0.779×ADF
1.3.2霉菌数量测定方法 按GB/T13093-2006规定方法测定饲料中霉菌数量。
1.3.3隶属函数评价 采用隶属函数评价法对苜蓿草捆不同处理的各个指标进行评价，得出最佳施用量。
计算公式为：UX(+)=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)；
UX(-)=1-UX(+)。
式中：UX(+)为各指标呈正相关隶属函数值，UX(-)为各指标呈负相关隶属函数值。Xij为某样品某指标测定值；
Ximax为某样品某指标最大测定值；
Ximin为某样品某指标最小测定值。
1.3.3数据分析 利用Excel 2019进行数据录入处理，用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，用Duncan方法对数据进行多重比较(P<0.05)。
2.1 添加柠檬酸对苜蓿草捆营养品质的影响
相同处理下，不同的贮藏时间，苜蓿草捆的CP含量有一定的差异(表1)。贮藏期间内，各组的CP含量随着贮藏时间的延长呈逐渐降低的趋势(P<0.05)。相同的贮藏时间不同处理间的CP含量存在差异。贮藏30，40与60 d时，N2与N3组的CP含量显著高于CK组(P<0.05)，贮藏50 d时，N3组的CP含量显著高于其他组(P<0.05)。随着贮藏时间的延长，CK组的EE含量显著降低(P<0.05)，柠檬酸处理的EE含量差异不显著。苜蓿草捆贮藏60 d时，CK组的EE含量显著低于其他3个处理组(P<0.05)；
贮藏期间内，同一贮藏天数不同处理组之间的EE含量差异不显著。随着贮藏时间的延长，苜蓿草捆的WSC含量显著降低(P<0.05)；
与第0 d相比，贮藏60 d时，CK，N1，N2与N3组的WSC含量分别降低了25.36%，18.27%，24.34%与14.50%。贮藏期间内，相同的贮藏时间不同的处理之间WSC含量差异不显著。总体而言，随着贮藏时间的延长，各组的NDF含量呈逐渐增加的趋势。相同贮藏时间，不同处理间的NDF含量差异显著(P<0.05)。N3组贮藏20与30 d时的NDF含量显著低于其他3个处理组(P<0.05)；
贮藏50与60 d时，柠檬酸处理的NDF含量显著低于CK组(P<0.05)。随着贮藏时间的延长，各组的ADF含量呈逐渐增加的趋势。相同贮藏时间不同处理的ADF含量差异显著(P<0.05)。贮藏20 d～40 d时，N2与N3组的ADF含量显著低于N1与CK处理组(P<0.05)；
贮藏50 d时，N2与N3组的ADF含量显著低于N1组(P<0.05)；
贮藏60 d时，N3组的ADF含量显著低于其他组(P<0.05)。总体而言，贮藏期间内不同处理的Ash含量差异不显著。
相同处理不同贮藏时间的苜蓿草捆的RFV差异显著(P<0.05)。随着贮藏时间的延长，各处理的RFV显著降低(P<0.05)。贮藏20 d时，N3组的RFV显著高于其他组(P<0.05)；
贮藏30与50 d时，柠檬酸处理的苜蓿草捆的RFV显著高于CK组(P<0.05)；
贮藏40与60 d时，N2与N3组的RFV显著高于CK与N1组(P<0.05)。
2.2 添加柠檬酸对苜蓿草捆霉菌数量的影响
贮藏过程中霉菌数量的变化如表2所示。贮藏期间内，随着贮藏时间的延长各组的苜蓿草捆霉菌数量呈先上升再下降的趋势。与第0 d相比，各组均在贮藏20 d时霉菌数量显著升高(P<0.05)，且达到最大值。与贮藏40 d相比，CK、N2与N3组的霉菌数量在贮藏50 d时，显著增加(P<0.05)。与贮藏50 d相比，贮藏60 d时，CK与N3组的霉菌数量显著降低(P<0.05)。贮藏20 d时，相同贮藏时间不同处理的霉菌数量差异不显著。贮藏至30 d时，N2与N3组的霉菌数量显著高于CK与N1组(P<0.05)；
贮藏40～60 d时，柠檬酸组的霉菌菌落数显著低于CK组(P<0.05)。
2.3 隶属函数评价
将各处理具有差异性的5个指标进行隶属函数分析，其中粗蛋白质(CP)与可溶性碳水化合物(WSC)为正向指标，中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、霉菌数量为负向指标(表3)。平均5项指标的隶属函数值进行综合价值的排序，平均值越大综合价值越高。贮藏20与40 d时，各处理综合价值排序为N3>N2>N1>CK；
贮藏30，50与60 d时，各处理综合价值排序为N3>N2 >CK>N1。
表1 不同处理对苜蓿草捆营养品质的动态影响Table 1 Dynamic effects of the different treatments on the nutritional quality of alfalfa bales 单位：% DM
表2 不同柠檬酸处理对苜蓿草捆霉菌数量的影响Table 2 Dynamic effects of different treatments on the amount of molds in the alfalfa hay bales 单位：104cfu·g-1
表3 隶属函数评价不同柠檬酸处理对苜蓿草捆综合价值的影响Table 3 Evaluation on the quality of alfalfa hay bales with different treatments at different storage days using membership functions
3.1 柠檬酸对苜蓿草捆营养品质的动态影响
贮藏过程中，植物的呼吸作用占据主导地位，营养物质向着分解的方向进行，多糖降解为单糖，蛋白质被水解为多肽、氨基酸等小分子物质，释放能量来维持其生理生化活动，且微生物能将苜蓿草捆中的大分子物质(淀粉、纤维素、蛋白质和脂肪等)水解为可溶性的低分子物质吸收到细胞内加以利用，使饲草的营养品质随着贮藏时间的延长逐渐下降[21]。本研究中，随着贮藏时间的延长，CP含量、WSC含量与RFV呈逐渐降低的趋势，NDF与ADF的含量呈逐渐升高的趋势。本研究结果与孙雷雷等[22-24]研究结果一致，原因可能是较长的贮藏时间需要更多的底物和能量去维持微生物生长繁殖的需要，也可能是贮藏期间营养物质能通过呼吸作用被分解为水和二氧化碳[25-26]，使营养品质随贮藏时间延长呈逐渐降低的趋势。
酸性添加剂能加速饲草的酸化，抑制蛋白等营养物质的降解和有害微生物的活动[22-23]，进而减缓营养物质的损失。本研究中苜蓿草捆中添加2%与3%柠檬酸后，贮藏30，40与60 d时的CP含量、贮藏40 d与60 d的RFV含量均显著高于对照组。原因可能是柠檬酸在饲草表面形成一层均匀的保护膜，且作为酸化剂能显著降低饲草pH，导致腐败真菌无法生存，霉菌数量降低，营养品质的损失量减少。研究报道称柠檬酸能抑制青贮过程中的蛋白降解，且柠檬酸的酸化能力，能破坏完整稳定的细胞壁结构，降低青贮后的纤维含量，RFV得到提高[20]，与本研究结果一致，这说明柠檬酸不仅能作用于青贮饲料，在干草中同样适用。
3.2 柠檬酸对苜蓿草捆霉菌数量的动态影响
霉菌数量能直观反映苜蓿草捆贮藏过程中是否发生霉变。本研究中霉菌数量均在贮藏20 d时达到最大值，之后逐渐降低，此变化规律与孙雷雷等[33]研究结果一致。原因可能是苜蓿刈割时会携带大量的田间真菌，打捆后苜蓿草捆中的真菌大肆生长，同时伴有植物呼吸作用，微生物就会大量繁殖、产热，使苜蓿草捆中的温度达到小高峰，之后由于草捆中的温度较高已不适于霉菌的生长，再加上贮藏环境的温度逐渐降低，均使草捆中的霉菌数量逐渐减少[34]。本研究中，添加2%与3%柠檬酸的苜蓿干草与贮藏30～60 d的霉菌数量显著低于对照组，说明2%与3%柠檬酸能显著抑制霉菌的增殖。王文娟[35]发现，在饲料中添加0.5%～5%柠檬酸能降低饲料的pH，抑制微生物的增殖，与本研究结果一致。
3.3 隶属函数评价柠檬酸对苜蓿草捆综合价值的影响
各处理在不同指标上表现均不相同，因此，以任何一个单一指标评价均是不全面的[36]。CP，WSC，NDF，ADF与霉菌数量是反映苜蓿草捆营养品质的重要指标，将平均5项指标的隶属函数值进行综合价值的排序，平均值越大综合价值越高。本研究中相同的贮藏时间内3%的柠檬酸处理后的苜蓿草捆综合价值最优，说明3%柠檬酸能显著减缓苜蓿草捆的营养品质下降的速率。
随着贮藏时间增加，苜蓿干草捆的WSC，CP，RFV呈逐渐降低的趋势，NDF与ADF呈逐渐增加的趋势。添加2%与3%柠檬酸能显著降低苜蓿干草捆贮藏30，40与60 d的CP含量，显著增加苜蓿干草贮藏30～60 d的RFV，其中将3%柠檬酸添加至苜蓿干草中，效果最佳；
贮藏期间内，随着贮藏时间的推移，苜蓿干草捆的霉菌数量呈二次增长变化趋势，贮藏30～60 d时，2%与3%柠檬酸能显著抑制霉菌数量的生长；
从隶属函数评价分析来看，相同贮藏时间内，苜蓿干草中添加3%柠檬酸后的综合价值最高。
