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周红艳 张薇 杨丹 王晓丽 时丽菲 孙江伟 王军
(1河南省中医药研究院中药药理实验室，河南 郑州 450004；
2河南省省立医院药学部)
高血压已成为心血管疾病中发病率较高的重大公共卫生问题之一。2012～2015年我国18岁及以上居民高血压患病粗率为27.9%(标化率23.2%)，患病率总体呈增高的趋势〔1〕。高血压是脑卒中、心肌梗死、肾功能不全最危险的因素，引发的靶器官损害严重危害人类健康〔2〕。肾脏参与血压的调节，也是高血压相关损害的重要靶器官。肾功能性障碍导致血压升高，形成恶性循环，并加剧其他靶器官损害。早期干预高血压进行性肾损害进程，阻断高血压-肾损害恶性循环，对控制血压及延缓高血压肾病的发生发展具有重要意义。研究表明，高血压肾损害与激肽释放酶激肽系统(KKS)联系密切，KKS是机体重要的调节系统，广泛地存在于组织和器官，在逆转血管重构、减轻血管损伤后再狭窄及减轻肾损害等方面发挥保护作用〔3,4〕。降压宝蓝片由大黄、龙胆草、萝芙木、黄芩等中药组成，具有清泻肝火、清利湿热功效，用于肝火亢盛型高血压治疗，临床疗效确切，具有降压及心、脑、肾靶器官保护作用。前期动物实验表明：降压宝蓝片对自发性高血压大鼠(SHR)有一定的降压作用，对SHR血管、心脏重构有不同程度的改善作用〔5〕。本研究选用SHR为实验动物，探讨降压宝蓝片对SHR肾损害及KKS的影响，探讨其可能的作用机制，为扩大其临床应用范围和进一步的深入研究提供科学依据。
1.1试验药物 降压宝蓝片由河南省中医药研究院附属医院制剂室提供，批号20150902；
马来酸依那普利片，江苏制药股份有限公司，批号15061002。
1.2动物 SPF级12周龄雄性SHR大鼠30只，12周龄雄性京都种(WKY)大鼠10只，体质量(200±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2015-0001，动物合格证：NO.1150060133361。研究所涉及的动物相关操作符合河南省中医药研究院动物伦理委员会的规定。
1.3仪器及试剂 Synergy NEO型多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，2K15型冷冻离心机(德国Sigma公司)，JXFSTPRP-cl全自动样品冷冻研磨仪(上海净信实业发展有限公司)，Asp-303型自动脱水机、EG-1250C型组织包埋机、RM-2135型石蜡切片机、DM4000型光学显微镜、QWin V3病理图像分析系统(德国Leica公司)，DYCP-24DN型电泳仪、DYCP-40C型转膜仪(北京市六一仪器厂)；
苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号325E038)，马松三色(Masson)染色试剂盒(福州迈新生物技术有限公司，批号1508178004)，大鼠缓激肽原(BK)、低分子量激肽(LK)、组织激肽释放酶(TK)、前列环素(PG)I2、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(江苏卡尔文生物科技有限公司，批号E20160301A)，BK2型受体(B2R，上海圣克鲁斯生物技术有限公司，批号sc-136216)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠，武汉三鹰生物技术有限公司(批号60004-1-Ig、SA00001-1)。
1.4方法
1.4.1分组与给药 实验动物适应性喂养1 w，随机分为模型(SHR)组、依那普利组(0.02 g/kg)、降压宝蓝片组(0.6 g/kg)，在前期的主要药效学研究中，共进行了3个剂量(1.2 g/kg、0.6 g/kg、0.3 g/kg)降压和降脂实验，本实验选择其中一个有效剂量(0.6 g/kg)进行靶器官保护作用机制研究。每组10只，以同龄同种系正常血压的WKY大鼠10只作为正常对照(WKY)组。灌胃给药，给药体积10 ml/(kg·d)，连续12 w。WKY组和SHR组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液。
1.4.2病理形态观察 取肾冠状切片，10%甲醛固定，常规脱水、石蜡包埋，横断面切片，分别进行HE染色、Masson染色，观察测量肾小球硬化指数(GSI)及肾组织间质胶原蛋白容积分数(CVF)。①GSI：肾小球硬化的定义为毛细血管腔塌陷和(或)玻璃样变。采用Raij等〔6〕半定量方法评估肾小球硬化程度，每张切片观察40个肾小球，根据肾小球硬化灶所占肾小球比例分为4级(0级：肾小球无病变；
1级：肾小球受损<25%；
2级：25%～50%肾小球受损；
3级：51%～75%肾小球受损；
4级：76%～100%肾小球受损)，根据不同级别肾小球硬化的例数，计算GSI。GSI=〔(1×N/40)+(2×N/40)+(3×N /40)+(4×N/40)〕×100。“N”表示不同级别的例数。②肾组织CVF：每张切片随机选取10个高倍视野(×400)，分别测量胶原蛋白面积和视野总面积，取平均值计算CVF。CVF=胶原蛋白面积/视野总面积×100。
1.4.3肾组织BK、TK、LK和PGI2含量测定 末次灌胃给药后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 g/kg)，肾组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液。按ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪于450 nm波长处分别测定BK、TK、LK和PGI2样品吸光度(A)，根据标准曲线的方程计算各样品含量。
1.4.4肾组织B2R蛋白表达测定 制备分离胶，分离胶凝固后制备浓缩胶并插入梳子，待浓缩胶凝固后拔出梳子加入蛋白质样品，接通电源开始电泳，电泳结束后按照纤维垫-滤纸-聚偏氟乙烯(PVDF)膜-分离胶-滤纸-纤维垫顺序制作三明治，4℃，100 V转膜120 min。转膜结束后将PVDF膜放入封闭液中，37℃封闭1 h。4℃一抗过夜，TBST洗膜6 min×3次，孵二抗1 h，TBST洗膜6 min×3次，曝光并用Image Studio对条带进行分析。
1.5统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。
2.1各组肾组织病理形态学 WKY组肾小球、肾小管无明显病理改变，可见少量胶原蛋白染色。SHR组可见肾小球体积缩小、塌陷及局灶性硬化，肾小管浑浊肿胀，基底膜增厚，偶见蛋白或红细胞管型，肾间质充血，可见炎性细胞浸润及间质纤维化，肾小球内及间质可见大量深染的胶原蛋白沉积。与SHR组比较，降压宝蓝片和依那普利组肾组织病理性改变及胶原蛋白沉积明显减轻，GSI、CVF明显降低(P<0.01)。见表1，图1、2。
2.2各组肾组织KKS比较 与WKY组比较，SHR组肾组织BK、PGI2含量显著降低(P<0.05)，TK含量有降低的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与SHR组比较，降压宝蓝片组及依那普利组显著升高肾组织PGI2含量(P<0.05，P<0.01)，降压宝蓝片组BK、TK、LK含量亦有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，依那普利组显著升高BK、TK(P<0.01)。见表1。
2.3降压宝蓝片对SHR肾组织B2R蛋白表达的影响 与WKY组比较，SHR组肾组织B2R蛋白表达明显降低(P<0.01)。与SHR组比较，依那普利及降压宝蓝片均能显著上调B2R蛋白表达(P<0.05)。见表1，图3。
表1 各组肾组织GSI和CVF、KKS及B2R蛋白表达比较
图1 各组肾组织形态学改变(HE染色，×200)
图2 各组肾组织胶原蛋白改变(Masson染色，×200)
1～4：WKY组、SHR组、依那普利组、降压宝蓝片组图3 各组肾组织B2R蛋白表达
高血压是慢性肾脏病发生发展的主要危险因素之一，临床上将高血压造成的肾脏结构和功能的改变，称为高血压肾损害，亦称高血压性肾病。本研究结果显示，SHR肾脏组织发生形态及结构上的病理变化：肾小球体积缩小、塌陷及局灶性硬化，内部间质有大量深染的胶原蛋白沉积，肾小管浑浊肿胀，基底膜增厚，肾间质充血，可见炎性细胞浸润及间质纤维化，肾组织GSI、CVF显著高于WKY组，符合高血压肾损害病理特征，与文献报道一致〔7,8〕。
肾脏局部KKS是肾-体液控制系统重要组成部分，KKS参与高血压-肾损害病理生理过程，当其受抑制则可导致钠潴留及高血压的发生〔9〕。KKS是一种内源性代谢级联系统，主要由激肽前体-激肽原、激肽释放酶、激肽及激肽受体组成〔10〕。激肽原是活性激肽的前体，其中LK为一种β-球蛋白，分子量50～68 kD，主要存在于血浆和各种组织中。LK在TK催化下，释放胰激肽(KD)和BK，TK是一种丝氨酸蛋白酶，它可以将低分子量的激肽原加工为具有生物活性的激肽和缓激肽，激肽具有血管活性，它可以触发KKS的瀑布级联反应〔11〕。BK是生理条件下主要的激肽类物质，是KKS发挥作用的主要成分，它是一种血管舒张因子。BK作用于血管内皮细胞膜B2R，使内皮细胞释放一氧化氮(NO)和PGI2等活性物质，通过扩张小动脉、增加局部血流和血管通透性、抑制胶原蛋白、炎症细胞及成纤维细胞聚集进而减轻血管重构及肾脏纤维化〔12〕。另一方面，BK还能促进水钠排泄，具有强大的利尿钠效应。静脉或动脉注射BK，能迅速地扩张全身血管，降低外周血管阻力，抑制钠水重吸收，增加肾小球滤过率，产生降压效应〔13,14〕。另有研究表明，中药能够升高血清BK、TK的表达量，激活激肽释放酶发挥降低血压，改善血管重构，发挥靶器官保护作用〔15〕。本研究结果显示，降压宝蓝片对SHR肾组织BK、TK、LK含量有升高的趋势，能明显升高肾组织中PGI2含量，显著上调B2R蛋白表达，说明降压宝蓝片能发挥舒张血管效应，通过扩张小动脉，增加血管通透性和组织血流量，抑制胶原蛋白、平滑肌细胞增殖进而减轻血管重构及肾脏纤维化。
高血压治疗的根本目标是降低高血压的心、脑、肾与血管并发症发生和死亡的总危险〔1〕。中医药具有这方面的优势，降压宝蓝片是河南省中医药研究院高血压中心系列医院制剂之一，用于肝火亢盛型高血压治疗。前期动物实验研究发现，降压宝蓝片有减轻SHR左室肥厚及左室重构的作用〔5〕；
临床研究发现，降压宝蓝片可降低高血压患者血浆同型半胱氨酸水平、左心室体积指数及颈动脉内膜中膜复合体厚度等指标，对左心室肥大和血管损伤有一定改善作用，可预防心血管事件及并发症的发生〔16,17〕。
综上，降压宝蓝片对SHR有肾保护作用，部分机制可能与上调KKS活性有关。
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