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李佳璐，董 媛，王 宇，张晓莉
DNA甲基化是目前研究最广泛、最深入的表观遗传修饰形式。它能够引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，调控基因表达，在肿瘤的发生发展中扮演重要角色[1]。研究表明，肿瘤抑制基因启动子和5 "区域的DNA 超甲基化是癌发生的早期事件[2]。妇科肿瘤方面，科研工作者们也在不断进行基因DNA甲基化方向的研究。Doorbar等[3]发现，宫颈癌的发生与某个或多个基因的启动子甲基化造成的基因表达缺失有着密切关系。PAX1基因是一种可以参与脊椎动物胚胎发生的转录调节因子[4]，经常因基因甲基化在宫颈癌中被沉默[5]。Lai等[6]发现，以PAX1为代表的一系列宫颈癌特异性甲基化基因在检测CIN3级及以上的样本时有较高的诊断价值。在针对亚洲人的多项 Meta分析研究中，Kon等[7]也发现在宫颈刮片中行PAX1基因甲基化和HPV检测的准确性要高于单独HPV检测。2019年，我国部分地区已批准PAX1基因甲基化检测作为细胞学辅助检测手段[8]。本研究旨在分析PAX1基因甲基化水平与宫颈高级别上皮内病变及HR-HPV分型之间关系，以及PAX1基因甲基化指导ASCUS患者分流中的临床意义。
1.1 研究对象 选取2021-06至2022-03在解放军总医院第三医学中心妇产科就诊患者。纳入标准：(1)自愿进行PAX1基因甲基化检测；
(2)进行机会性筛查者；
(3)因宫颈病变治疗后随访以及评价疗效者。排除标准：(1)生殖系统恶性肿瘤及免疫系统疾病患者；
(2)妊娠期；
(3)就诊时有下生殖道及外阴、阴道、宫颈等急性感染性疾病者或合并其他性传播疾病患者。根据专家共识[9]，选取TCT结果异常≥意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)和(或)高危人类乳头状病毒(high-risk human papillmavirus DNA，HR-HPV)阳性患者194例；
根据阴道镜应用标准，转诊阴道镜下取病理活检的患者共130例。入组患者分别进行液基薄层细胞检测(Thinprep cytologic test，TCT)和人乳头瘤病毒-DNA(HPV-DNA)分型检测、定量PAX1基因甲基化检测。研究对象平均年龄(40.62±4.90)岁；
其中未见上皮内细胞病变(no intraepithelial cell lesions were found，NILM)为21例，意义不明确的非典型鳞状细胞(atypical squamouscells of undtermined significance，ASC-US)为45例，不除外高度鳞状上皮内病变(atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion，ASC-H)为5例，或低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)为37例，高度鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)为22例；
单一感染HPV16、18和非HPV16/18阳性患者分别为43、30和85例。本研究经解放军总医院第三医学中心伦理委员会批准(批准号：2021-D04-09)。入组患者均自愿参加该项临床研究且已签署相关知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 宫颈脱落细胞收集 非月经期内予以取材，纱布或棉球拭净宫颈表面分泌物，取材刷于宫颈表面及宫颈管内顺时针充分旋转10周，将刷到的组织脱落细胞移入细胞固定液的瓶内保存。
1.2.2 TCT检测 采用新柏氏薄层细胞检测系统对标本进行处理，病理科医师阅片诊断。细胞学诊断报告参考2014年修订的宫颈细胞学结果分级系统(the bethesda system，TBS)，结果分为正常(NILM)、不明意义的非典型鳞状上皮细胞(ASC-US)、非典型鳞状细胞不除外高度病变(ASC-H)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)。
1.2.3 HR-HPV DNA检测 采用Cobas 4800检测系统对宫颈脱落细胞进行HR-HPV DNA检测。
1.2.4 PAX1基因甲基化检测 核酸提取试剂盒(OC130)提取宫颈刮片细胞中的基因组DNA(gDNA)，两步法PCR扩增，对提取gDNA进行甲基化处理后，两步法PCR制备测序文库，并对测序文库进行定量与质控，最后经定量的文库采用基因测序仪进行高通量测序。甲基化评分算法：以本试剂盒提供DNA内参，根据PAX1基因与内参基因的Cp值，计算△Cp。其中，PAX1基因甲基化数值的大小将反映PAX1基因甲基化的程度，PAX1基因甲基化数值的高低与PAX1基因甲基化的程度呈反比(即△Cp值越小，PAX1基因甲基化程度越大)。
1.2.5 阴道镜检查 由同一名阴道镜医师完成阴道镜检查，可疑部位取材活检；
若未见明显异常，则在宫颈3、6、9、12点多点活检。宫颈管内可疑病变，必要时行颈管内膜诊刮术(endocervical curettage，ECC)。病理切片由同一名病理科医师判读，另一名病理科医师审核结果。
1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0 软件处理数据，计量资料采用 Shapiro-Wiilk(S-W)方法进行正态分布检验，测定指标值均不符合正态分布，采用四分位数[中位数(25%，75%)]来进行描述，组间差异采用非参数秩和，两独立样本的非参数检验方法为Mann-WhitneyU检验，多样本间两两比较的非参数检验方法为Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 活检患者的PAX1基因甲基化程度 采集130例完整资料，其中CIN3+患者的甲基化程度为18.21(17.56，18.66)，高于正常/宫颈炎[20.5(20.07，20.80)]、CIN1[20.41(20.19，20.72)]及 CIN2[20.21(19.77，20.42)]患者，差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2 ASCUS患者PAX1基因甲基化程度 TCT诊断为ASCUS患者，最终取得病理的为45例。其中正常/CIN1患者23例，CIN2+(CIN2、CIN3和宫颈癌)患者23例。正常/CIN1患者的PAX1基因甲基化数值的CP值为20.51(20.19，20.73)；
CIN2+的患者PAX1基因甲基化CP值为18.87(17.80，20.26)，两者差异有统计学意义(P<0.01)。
2.3 不同类型HPV感染患者PAX1基因甲基化程度 选择单一感染HPV16、HPV18和非HPV16/18阳性患者，比较其PAX1基因甲基化程度。单一感染HPV16患者的PAX1基因甲基化程度为19.10(17.97，19.88)，单一感染HPV18患者的PAX1基因甲基化程度19.49(18.65，20.31)，均高于非HPV16/18阳性20.33(20.00，20.50)的患者，差异有统计学意义(P<0.001)，HPV18阳性与非HPV16/18阳性患者间的PAX1基因甲基化程度差异有统计学意义(P<0.001)。但单一HPV16阳性与单一HPV18阳性患者的PAX1基因甲基化数值比较差异无统计学意义(P>0.05)。
HPV在人体正常宫颈上皮细胞中持续性感染是宫颈癌发生的主要诱因之一[10]。TCT整个检测流程受到人为因素影响较大，可能会导致低估患者宫颈上皮内病变的程度，或对反应性改变做出一系列过度诊断。HPV-DNA检测有较高的灵敏度，但特异性不高[11]。这可能会导致过度治疗[12-13]。故寻找不依赖于传统的形态学观察、诊断效能更高且简便易行的分子生物学筛查标记物十分重要。Kelly和Fang等[14-15]研究发现，基因DNA甲基化与宫颈癌的发生和进展有相关性。Liu等[16]也发现PAX1基因甲基化程度在宫颈癌患者中显著高于其他宫颈病变患者。
本文研究结果显示，PAX1基因甲基化数值高低与宫颈病变进展程度有关，PAX1基因的甲基化水平随着宫颈病变程度的加深而逐渐增高。高危型HPV感染后3～5年即可进展为高级别病变，但由高级别病变进展成宫颈癌可能需要20～30年[3]。这为临床上我们进行宫颈癌的早期筛查以及在癌前病变阶段实行有效的干预措施提供了可能。
ASCUS是一种十分“令人头疼”TCT检测结果。2018年JAMA指南指出：在中国进行细胞学检查的患者中，有10%的结果诊断为ASCUS和LSIL[17]。ASCUS的患者需在6～12个月重复细胞学检查，或利用HR-HPV DNA分流。但HPV-DNA检验的特异性差，重复检查浪费医疗资源。本研究也发现，ASCUS患者中，CIN2+的PAX1基因甲基化数值显著高于正常/CIN1。结果表明定量PAX1基因甲基化检测有助于早期识别ASCUS宫颈高级别病变，也有助于降低ASCUS阴道镜转诊率。
王文杰等[18]研究表明，感染最高风险致癌型HPV16/18阳性比与非HPV16/18阳性患者PAX1检出率不同。笔者发现，其中单一HPV16阳性、单一HPV18阳性患者的PAX1基因甲基化的数值显著高于非HPV16/18阳性患者。推测HPV16/18的感染机制不同于非HPV16/18阳性。高危型HPV16/18对于PAX1基因甲基化过程的的影响更大，且HPV16型强于HPV18型。国外研发了六基因(ASTN1、DLX1、ITGA4、RXFP3、SOX17 和 ZNF671)DNA甲基化标记物组，发现它具有更高特异性和较高的灵敏度。目前该项检测已被开发为GynTect，已于2015年9月获得上海国际临床检验及实验室设备展览会(CEIVD)认证[19]。相比于其它的宫颈癌DNA甲基化标记物，如CADM1、MAL、miR124、FAM19A4、ZNF582、SOX1和NKX6-1，GynTect检测显示相似的灵敏度，且具优势的特异性[20]。
今后研究中，课题组将联合应用多基因甲基化检测，组织前瞻性、大规模的临床试验，进行更深入的研究以寻找更好的生物学筛查标记物。
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