灰毡毛忍冬花蕾乙醇提取物中酚酸类化学成分

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姚静远, 单 宇, 鲁正熹, 吴君芝, 王湘莹, 王晓明, 冯 煦, 陈 雨,①

〔1. 南京中医药大学, 江苏 南京210023; 2. 江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏省植物资源研究与利用重点实验室 江苏省中药材生态种植与高值化利用工程研究中心, 江苏 南京 210014;3. 江苏卫生健康职业学院, 江苏 南京 210029; 4. 湖南省林业科学院, 湖南 长沙 410004〕

灰毡毛忍冬(LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(LoniceraLinn.)藤本植物，为“山银花”中药材的主要来源植物之一[1]，其主要成分为酚酸类、皂苷类、环烯醚萜类以及黄酮类化合物[2-5]，其中，酚酸类成分作为灰毡毛忍冬主要药用成分之一，具有抗病毒、抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗炎和抗菌[2]等药理活性。本研究通过对灰毡毛忍冬花蕾体积分数70%乙醇提取物进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析，根据酚酸类物质的质谱特征碎片离子峰和紫外吸收光谱特征峰，从该提取物中鉴定到若干未知酚酸类衍生物，并对其中的酚酸类化学成分进行进一步的分离和结构测定，以期为深入开发利用灰毡毛忍冬酚酸类成分提供物质基础。

1.1 材料

灰毡毛忍冬品种‘花瑶晚熟’(‘Huayao Serotino-matura’)花蕾于2020年7月采自湖南隆回县，人工栽培，并经江苏省中国科学院植物研究所田梅助理研究员鉴定。灰毡毛忍冬花蕾采摘后分多层置于50 ℃烘箱内干燥20 h，备用。

主要仪器：ZF-20D暗箱式紫外分析仪(郑州龙翔仪器有限公司)；
Bruker AV-300/500核磁共振光谱仪(瑞士Bruker公司)；
Agilent 1100高效液相色谱仪，Agilent 1100 LC/MSD SL液相质谱联用仪(美国Agilent公司)；
Shimadzu LC-20 AR半制备型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)。

主要试剂：柱层析硅胶(青岛海洋化工有限公司)，RP-18(日本YMC公司，12 nm)，Sephadex LH-20(美国Pharmacia公司)，柱色谱试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，高效液相色谱试剂均为色谱纯(美国TEDIA公司)。

1.2 方法

1.2.1 化合物分离 取8 kg样品，用体积分数70%乙醇回流提取3次，每次3 h；
提取液合并后减压浓缩至无醇味，经D101型大孔树脂柱分离，依次用超纯水、体积分数30%乙醇、体积分数70%乙醇和体积分数95%乙醇洗脱得到Fr.Ⅰ(1 200 g)、Fr.Ⅱ(132 g)、Fr.Ⅲ(600 g)和Fr.Ⅳ(30 g)4个部分。Fr.Ⅱ部分经RP-18反相柱层析(填料600 g)分离，依次用体积分数10%乙醇、体积分数20%乙醇、体积分数30%乙醇和体积分数95%乙醇洗脱，合并组分相似的洗脱液，浓缩后得Fr.Ⅱ-A、Fr.Ⅱ-B(24 g)、Fr.Ⅱ-C(32 g)和 Fr.Ⅱ-D 4个部分。运用RP-8反相柱层析和半制备型高效液相色谱仪分离等方法，从Fr.Ⅱ-B部分分离得到化合物1(250 mg)、化合物2(1.5 g)、化合物3(70 mg)和化合物4(40 mg)，从Fr.Ⅱ-C部分分离得到化合物5(72 mg)、化合物6(40 mg)、化合物7(62 mg)、化合物8(54 mg)和化合物9(68 mg)。将所得到的化合物的理化性质和波谱数据与相关文献数据对比，确定化合物结构。

1.2.2 高效液相条件 Agilent Eclipse CDS-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国Agilent公司)，柱温30 ℃，流动相为甲醇-体积分数0.4%乙酸的混合溶液(体积比 15∶85)，流速0.8 mL·min-1，检测波长330 nm。

化合物1：浅黄色粉末(甲醇)，薄层层析(TLC)紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，高效液相检测与咖啡酸标准品保留时间相同(tR=31.45 min)，故鉴定为咖啡酸(caffeic acid)。

化合物2：灰白色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，喷三氯化铁试液显污绿色。ESI-MSm/z：353[M-H]-，相对分子质量354，分子式C16H18O9。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：7.95(1H，d，J=15.9 Hz，H-7′)，7.46(1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，7.13(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，7.03(1H，dd，J=8.1，2.1 Hz，H-6′)，6.55(1H，d，J=15.9 Hz，H-8′)，6.20(1H，m，H-3)，4.76(1H，m，H-5)，4.30(1H，dd，J=8.3，3.1 Hz，H-4)，2.93～2.68(4H，m，H-2，6)；
13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：177.2(C-7)，167.2(C-9′)，147.6(C-4′)，145.9(C-7′)，145.7(C-3′)，126.9(C-1′)，121.9(C-6′)，116.7(C-5′)，115.8(C-8′)，115.5(C-2′)，76.0(C-1)，73.6(C-4)，72.3(C-3)，71.2(C-5)，39.3(C-2)，38.8(C-6)。以上波谱数据与文献[6]基本一致，故鉴定为绿原酸(chlorogenic acid)。

化合物3：浅黄色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，喷三氯化铁试液显污绿色。高效液相检测与4-O-咖啡酰奎宁酸标准品保留时间相同(tR=22.95 min)，故鉴定为4-O-咖啡酰奎宁酸(4-O-caffeoylquinic acid)。

化合物4：白色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，喷三氯化铁试液显污绿色。ESI-MSm/z：353[M-H]-，相对分子质量354，分子式C16H18O9。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：7.46(1H，d，J=15.9 Hz，H-7′)，7.01(1H，d，J=2.1 Hz，H-2′)，6.96(1H，dd，J=8.1，2.1 Hz，H-6′)，6.76(1H，d，J=8.1 Hz，H-5′)，6.18(1H，d，J=15.9 Hz，H-8′)，5.17(1H，m，H-5)，4.82(1H，m，H-3)，3.86(1H，m，H-4)，2.02～1.85(4H，m，H-2，6)；
13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：175.9(C-7)，165.9(C-9′)，148.1(C-4′)，145.5(C-7′)，144.2(C-3′)，125.6(C-1′)，120.9(C-6′)，115.7(C-5′)，115.0(C-8′)，114.5(C-2′)，72.8(C-1)，72.2(C-4)，70.9(C-3)，67.2(C-5)，38.9(C-2)，35.1(C-6)。以上波谱数据与文献[7]基本一致，故鉴定为5-O-咖啡酰奎宁酸(5-O-caffeoylquinic acid)。

化合物5：淡黄色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，喷三氯化铁试液显污绿色。ESI-MSm/z：515[M-H]-，相对分子质量516，分子式C25H24O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.46，7.44(each 1H，d，J=15.6 Hz，H-7′，H-7″)，7.04～6.93(4H，m，H-2′，H-2″，H-6′，H-6″)，6.73，6.72(each 1H，d，J=8.1 Hz，H-5′，H-5″)，6.23，6.18(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.41(1H，m，H-5)，4.93(1H，m，H-3)，3.75(1H，m，H-4)，2.19(2H，m，Heq-2，6)，1.96(2H，m，Hax-2，6)。13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：175.7(C-7)，165.9(C-9′，C-9″)，148.4(C-4′，C-4″)，145.5(C-3′，C-3″)，145.2(C-7′，C-7″)，125.5(C-1′，C-1″)，121.3(C-6′，C-6″)，115.7(C-5′，C-5″)，114.7(C-2′，C-2″)，113.9(C-8′)，113.5(C-8″)，73.5(C-1)，72.6(C-5)，68.3(C-4)，64.2(C-3)，38.6(C-2)，35.6(C-6)，以上波谱数据与文献[8-9]基本一致，故鉴定为3，5-O-二咖啡酰奎宁酸(3,5-O-dicaffeoylquinic acid)。

化合物6：淡黄色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，喷三氯化铁试液显污绿色。ESI-MSm/z：515[M-H]-，相对分子质量516，分子式C25H24O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.49，7.43(each 1H，d，J=5.9 Hz，H-7′，H-7″)，7.02，7.01(each 1H，d，J=2.1 Hz，H-2′，H-2″)，6.98，6.95(each 1H，dd，J=2.1，8.2 Hz，H-6′，H-6″)，6.74(2H，d，J=8.2 Hz，H-5′，H-5″)，6.24，6.14(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.36(1H，m，H-3)，5.11(1H，d，J=6.1 Hz，H-4)，4.37(1H，dd，J=7.7，3.0 Hz，H-5)，2.17(2H，m，H-2)，2.04(1H，m，Heq-6)，1.92(1H，m，Hax-6)；
13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：174.5(C-7)，165.9，165.4(C-9′，C-9″)，145.5(C-3′，C-3″)，148.4(C-4′，C-4″)，145.4(C-7′，C-7″)，125.4(C-1′，C-1″)，121.4(C-6′)，121.3(C-6″)，115.7(C-5′，C-5″)，114.8(C-2′，C-2″)，113.8(C-8′)，113.6(C-8″)，73.4(C-1)，73.1(C-4)，67.5(C-5)，66.1(C-3)，37.4(C-2)，37.0(C-6)，以上波谱数据与文献[10]基本一致，故鉴定为3，4-O-二咖啡酰奎宁酸(3,4-O-dicaffeoylquinic acid)。

化合物7：淡黄色粉末(甲醇)，TLC 紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，喷三氯化铁试液显污绿色。ESI-MSm/z：515[M-H]-，相对分子质量516，分子式C25H24O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.48，7.43(each 1H，d，J=15.8 Hz，H-7′，H-7″)，7.06，7.03(each 1H，d，J=1.8 Hz，H-2′，H-2″)，7.01，6.98(each 1H，dd，J=1.7，8.3 Hz，H-6′，H-6″)，6.77，6.76(each 1H，d，J=8.1 Hz，H-5′，H-5″)，6.24，6.16(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.24(1H，m，H-5)，5.15(1H，m，H-4)，3.82(1H，m，H-3)，2.10(2H，m，Heq-2，6)，1.94(2H，m，Hax-2，6)；
13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：175.5(C-7)，166.1(C-9′)，165.6(C-9″)，148.3(C-4′)，148.2(C-4″)，145.5(C-3′，C-3″)，145.0(C-7′)，144.6(C-7″)，125.6(C-1′)，125.5(C-1″)，121.3(C-6′)，121.1(C-6″)，115.8(C-5′)，115.7(C-5″)，114.8(C-2′，C-2″)，114.7(C-8′，C-8″)，72.5(C-1)，70.1(C-4,C-5)，67.8(C-3)，36.2(C-2)，34.8(C-6)，以上波谱数据与文献[11]基本一致，故鉴定为4，5-O-二咖啡酰奎宁酸(4,5-O-dicaffeoylquinic acid)。

化合物8：淡黄色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，喷三氯化铁试液显污绿色。ESI-MSm/z：543[M-H]-，545[M+H]+，相对分子质量544，分子式C27H28O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.51，7.42(each 1H，d，J=15.8 Hz，H-7′，H-7″)，7.04，7.02(each 1H，d，J=1.9 Hz，H-2′，H-2″)，6.98，6.95(each 1H，dd，J=2.1，8.1 Hz，H-6′，H-6″)，6.75(2H，d，J=8.1 Hz，H-5′，H-5″)，6.26，6.13(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.27(1H，m，H-3)，4.96(1H，dd，J=6.6，3.0 Hz，H-4)，4.09(1H，d，J=6.1 Hz，H-5)，4.04(2H，m，-CH2CH3)，2.26(2H，m，H-2)，2.01(1H，m，Heq-6)，1.89(1H，m，Hax-6)，1.15(3H，t，-CH2CH3)。13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：172.8(C-7)，165.8(C-9′)，165.2(C-9″)，148.6(C-4′)，148.5(C-4″)，145.6(C-3′)，145.5(C-3″)，145.4(C-7′，C-7″)，125.4(C-1′)，125.2(C-1″)，121.4(C-6′)，121.3(C-6″)，115.7(C-5′，C-5″)，114.8(C-2′)，114.7(C-2″)，113.8(C-8′)，113.3(C-8″)，73.1(C-1)，72.2(C-4)，67.7(C-5)，65.4(C-3)，60.5(C-8)，37.6(C-2)，36.1(C-6)，13.8(C-9)，以上波谱数据与文献[12]基本一致，故鉴定为3，4-O-二咖啡酰奎宁酸乙酯(3,4-O-dicaffeoylquinic acid ethyl ester)。

化合物9：淡黄色粉末(甲醇)，TLC紫外光(波长365 nm)下显蓝色荧光，喷三氯化铁试液显污绿色。ESI-MSm/z：543[M-H]-，545[M+H]+，相对分子质量544，分子式C27H28O12。1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ：7.51，7.43(each 1H，d，J=15.8 Hz，H-7′，H-7″)，7.04～6.93(4H，m，H-2′，H-2″，H-6′，H-6″)，6.77(2H，d，J=8.1 Hz，H-5′，H-5″)，6.25，6.13(each 1H，d，J=15.9 Hz，H-8′，H-8″)，5.20(1H，m，H-5)，5.08(1H，m，H-4)，4.07(2H，m，-CH2CH3)，3.85(1H，m，H-3)，2.06(2H，m，Heq-2，6)，1.96(2H，m，Hax-2，6)，1.15(3H，t，-CH2CH3)。13C-NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ：173.1(C-7)，165.9(C-9′)，165.2(C-9″)，148.5(C-4′)，148.3(C-4″)，145.6(C-3′，C-3″)，145.2(C-7′)，144.9(C-7″)，125.6(C-1′)，125.3(C-1″)，115.8(C-5′)，115.7(C-5″)，121.3(C-6′)，121.1(C-6″)，114.7(C-2′)，114.6(C-2″)，114.5(C-8′)，113.6(C-8″)，72.4(C-1)，70.9(C-4)，69.9(C-5)，66.7(C-3)，60.3(C-8)，34.7(C-2)，34.4(C-6)，13.9(C-9)，以上波谱数据与文献[13]基本一致，故鉴定为4，5-O-二咖啡酰奎宁酸乙酯(4,5-O-dicaffeoylquinic acid ethyl ester)。

本研究从灰毡毛忍冬花蕾乙醇提取物中分离得到9个酚酸类化合物，丰富了灰毡毛忍冬中的酚酸类成分。其中，化合物4、5、6、7、8和9均为首次从灰毡毛忍冬中分离获得。

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