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【摘要】 目的 研究凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)对胆囊癌细胞GBC-SD凋亡的体外诱导作用及其可能的作用机制。方法 采用流式细胞术检测TSP-1及其受体CD36，CD47作用后HCCLM3的凋亡率，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Caspase-3 mRNA表达的变化。结果 TSP-1组凋亡率(10．56±0．63)%显著高于对照组(3．17±0．33)%和CD47阻断组(4．05±0．27)%(P[1]。胆囊癌的发生、发展的各步骤是在多种细胞因子共同作用下发生的。凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)是一种多功能糖蛋白，可调节肿瘤细胞的生长、粘附、迁移等生物学行为[2]。但对胆囊癌细胞作用的研究尚未见报道，本文通过体外细胞培养的方式，研究TSP-1对胆囊癌细胞株GBC-SD凋亡的作用及其发挥作用的可能途径。
1 材料与方法
1．1 材料 TSP-1蛋白，CD47单抗，CD36单抗购于Sigma公司，胆囊癌细胞系 GBC-SD购于复旦大学肝癌研究所，总RNA分离试剂盒(Gibco公司)， AMV为TaKaRa公司产品，dNTP购自上海生工生物工程公司,引物由上海生工生物公司合成，TagTMDNA聚合酶为TaKaRa产品。
1．2 实验方法
1．2．1 细胞培养 胆囊癌细胞GBC-SD在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液(含双抗)，37℃含5%CO2孵箱培养，对数生长期细胞为实验对象。
1．2．2 分组 按照处理因素把GBC-SD分为4组，实验组(加入TSP-1蛋白40 g/ml)、CD36阻断组和CD47阻断组(浓度为5 g/ ml单抗孵育30 min后加入TSP-1蛋白)、对照组，培养72 h。
1．2．3 流式细胞术检测GBC-SD细胞凋亡率 收获各组细胞后，70%冷乙醇固定，1 mg/ml RNase A 10 μl于37℃水浴30 min，100 g/ml碘化丙锭(PI) 50 μl,4℃避光20 min， 调整细胞浓度为1×106/ml，上机检测，CellQuest软件分析凋亡细胞数。
1．2．4 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) Trizol一步法提取组织总RNA，逆转录合成cDNA，配成50 L反应体系行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性2 min，95℃变性2 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，72℃延伸10 min，产物于1．2%的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭紫外灯下观察拍照。
1．3 统计学处理 数据采用SPSS11．5数据包统计处理，各计量资料均用均数±标准差表示(x±s)，多组之间的比较采用多样本均数的单因素方差分析。
2 结果
2．1 流式细胞术检测细胞凋亡的结果 TSP-1组(10．56±0．63)%显著高于对照组(3．17±0．33)%, (P0．05)。CD36阻断组(8．49±0．37)%与对照组和TSP-1组比较均差异有统计学意义(P 2．2 TSP－1对HCCLM3细胞Caspase3表达的作用 Caspase3 mRNA PCR扩增产物凝胶电泳图谱在212bp和647 bp位置分别可见GAPDH和Caspase3 mRNA清晰条带。TSP-1组(0．575±0．026)和CD36阻断组(0．583±0．023)中Caspase3 mRNA的表达显著高于对照组(0．336±0．031)和CD47阻断组(0．412±0．017) (P[3]，所以研究诱导胆囊癌细胞凋亡的调控因素及其作用途径显得十分必要，并且对于阐明胆囊癌的发生、进展机制，进而寻找可能的靶向治疗的分子标志具有一定的意义。
在众多的相互作用的细胞因子网络中，TSP-1是被较早发现的一种多功能糖蛋白[4]，可通过分子内部各功能区与细胞外基质、粘附分子、及其受体等相互作用从而诱导其他肿瘤细胞凋亡。TSP-1与胆囊癌细胞的凋亡有无关系尚未见报道。本实验通过体外研究显示：TSP-1作用于胆囊癌细胞株GBC-SD 72 h后细胞凋亡显著增加。而经过特异性单抗受体CD47与TSP-1的结合后，凋亡率与TSP-1组比较显著降低，而与对照组相比无差异，阻断了TSP-1诱导HCCLM3细胞调亡的作用；阻断TSP-1与受体CD36的结合后凋亡率与对照组和TSP-1组比较均有显著性差异，但对于TSP-1的阻断作用远低于CD47抗体阻断组。提示TSP-1诱导胆囊癌细胞凋亡的作用主要是通过与CD47的结合激活下游分子而发挥作用的。
Caspase-3是直接诱导各种肿瘤细胞凋亡的关键因子，有研究显示随Caspase-3的异常表达与胆囊癌的病理特征和预后密切相关，体外实验也证实Caspase-3在胆囊癌细胞的凋亡过程中也发挥了重要作用[3]。本研究发现TSP-1作用于GBC-SD后Caspase 3表达量与对照组相比显著增加，而CD47阻断组与TSP-1组相比Caspase 3 表达量显著下降，而CD36阻断组与TSP-1组相比差异不显著，说明TSP-1诱导HCCLM3凋亡的作用途径之一是通过与受体CD47结合后上调Caspase 3的表达来实现。有报道CD47可与TSP-1的羧基端细胞结合域(CBD)结合,调节整合素活性 [5]。Caspase-3导致细胞凋亡的机制有可能是酶切凋亡抑制蛋白bcl-2使其失去抑制细胞凋亡的生物活性 [6]；还可直接裂解细胞组分或裂解细胞骨架调节蛋白导致细胞裂解凋亡[7]。
以上结果说明TSP-1在胆囊癌凋亡的调控网络中具有一定作用，而通过与受体CD47的结合可能是其发挥作用的主要途径。CD36也可部分介导TSP-1诱导凋亡，但作用较弱。TSP-1的作用具有多样性，完全阐明其作用和作用机制尚需更进一步的深入研究。
参考文献
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