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【摘要】 目的 观察梓醇对L-Glu和Aβ25-35损伤PC12细胞的保护作用的异同。方法 常规培养神经元样PC12细胞，预先加入梓醇及对照生理盐水24 h后分别加L-Glu 5 mmol/L和Aβ25-35 20μmol/L损伤24 h，K252a 干预组细胞在梓醇前1 h加入200 nmol/L K252a。MTT法测定细胞存活率，放射配基结合分析测定M2受体密度。结果 梓醇100 μmol/L明显提高细胞存活率(P25-35 损伤细胞的保护作用，对梓醇保护L-Glu损伤的阻断作用更强。结论 梓醇对L-Glu和Aβ25-35损伤PC12细胞保护作用有差异。
【关键词】 梓醇；PC12细胞；L-Glu；Aβ25-35；K252a
Compare of the protective effect of catalpol on PC12 cells injury induced by L-glutamate and Aβ25-35 WANG Jin-hong,ZHU Su-hua,SUN Shan-ming,et al.Department of Pharmacology, Weifang Medical College, Weifang 261042, China
【Abstract】 Objective AimTo observe the difference between effect of catalpol on PC12 cells injury induced by L-glutamate and Aβ25-35. Methods Neuron-like PC12 cells were cultured, 24 h after cells were exposed to catalpol 10 μmol/L,100 μmol/L and saline control respectively. L-Glutamate 5 mmol/L and Aβ25-35 20 μmol/L was added another 24 h later and stayed in DMEM for 24 h. When necessary, 200 nmol/L K252a was added 1 h before catalpol addition. Cell viability was measured by MTT assay, M2 receptor density was measured by single point 3 h-QNB binding assay. Results Catalpol elevated cell viability at the final dose of 100 μmol/L(P25-35 but blocked the effect on cells injured by L-glutamate more significant. Conclusion There were some difference between the protective effect of catalpol on PC12 cells injured by L-glutamate and Aβ25-35 respectively.
【Key words】 Catalpol; PC12 cell; L-glutamate; Aβ25-35；K252a
梓醇是滋阴药地黄的主要活性成分，近年研究表明其有显著神经保护作用[1-3]。我们前期研究发现梓醇保护Aβ25-35 损伤PC12 细胞及脑内注射Aβ25-35 拟痴呆小鼠的胆碱能神经系统功能，保护兴奋性神经递质谷氨酸(glutamate, Glu)对细胞的神经毒性，显著改善老年痴呆的病理变化。研究中发现梓醇对Aβ25-35和L-Glu损伤PC12细胞的保护作用不同，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1．1 主要试剂 鲜地黄采于河南省温县。梓醇从鲜地黄经乙醇和正丁醇提取，硅胶柱分离，重结晶纯化制得，经高效液相色谱和质谱鉴定，纯度>95%。DMEM (Gibco ,USA)，Aβ25-35、L-Glu、K252a、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(sigma ,USA)，3 h-QNB(Amersham 公司，比活度1．54 TBq/ mmol)。Aβ25-35 用灭菌双蒸水溶解后配成100mol/L母液无菌分装，-20℃储存，临用前37℃孵育3~5 d使成为聚集状态[4]，加入DMEM稀释成所需浓度。
1．2 方法
1．2．1 细胞培养及处理 PC12 细胞由中国科学院上海细胞生物研究所提供，置CO2 培养箱内37℃常规培养，DMEM内含10%胎牛血清、0．1 U/L 青霉素和0．1 g/L 链霉素。细胞长至铺满瓶底约90%时收集细胞传代，24 h换液并加入不同浓度梓醇预处理细胞，正常对照和模型组细胞加等体积生理盐水。继续培养24 h，除正常对照组细胞外，其余细胞分别加入终浓度5 mmol/L L-Glu持续损伤24 h即细胞培养至72 h进行指标检测(所有加药体积均为10l/孔)。20mol/L Aβ25-35 损伤细胞的实验方法同上。
1．2．2 细胞存活率测定(MTT 法) 细胞以2×107/L接种于96 孔板，每孔200L。检测时每孔加5 g/L MTT溶液20L，使终浓度0．5 g/L，37℃孵育4 h，弃上清液，每孔加DMSO 150L，振荡10 min，酶标仪测490 nm 的光密度(OD)。细胞存活率(%)=用药组细胞OD/对照组细胞OD×100%。
1．2．3 细胞M受体密度测定 细胞以2×108/L较高密度接种于6 孔培养板内，每孔2 mL。M受体密度采用 3 h-QNB单位点结合法测定。培养细胞每孔加适量预冷至4℃的0．01 mol/L PBS轻轻刮取细胞，离心1 800 g×10 min得到细胞团块，加B1 缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7．4，内含10 mmol/L MgCl2)混匀制成匀浆。测定时每管均加入细胞匀浆100L(约100~200g 蛋白)，总结合管(TB)加B1 缓冲液和3 h-QNB 液各100L，非特异结合管(NSB)加B1 缓冲液和阿托品各100L，总反应体积均为300L(以上所有操作在4℃进行)。37℃振荡孵育45 min反应，反应结束后立即置冰浴终止反应，迅速抽滤至双层69 型玻璃纤维滤膜，滤膜预先用0．25%PEI浸泡以降低非特异结合。滤膜80℃烘干1 h后浸入1 mL 0．6%b-PBD二甲苯溶液，液体闪烁仪测放射性计数率(cpm)，Lowry 法测定蛋白含量。PC12 细胞M受体密度计算公式=总结合(cpm)－非特异结合(cpm)测量效率(%)×标记物比活度(cpm/fmol)×标本蛋白量
1．2．4 K252a对梓醇作用的影响 细胞以2×105/ml 较高密度接种于6 孔培养板内，每孔2 mL。分为：正常对照组，模型组，梓醇终浓度100 μmol/L保护组和200 nmol/L K252a干预梓醇保护组。其中K252a干预组细胞在加梓醇保护前1 h即细胞培养至23 h预先加入终浓度200 nmol/L的K252a干预，余处理同前。同上测定细胞M受体密度。
1．3 统计学分析 所有数据以（x±s）表示，单因素方差分析，P25-35 20mol/L分别作用于PC12 细胞24 h后细胞蓝紫色结晶明显减少，说明细胞存活率明显下降，分别下降为正常对照组的62．4%和70．1%(P25-35 对PC12 细胞M胆碱系统都显示明显的毒性作用，5 mmol/L L-Glu和20mol/L Aβ25-35 分别作用24 h后，PC12 细胞M受体密度明显下降(P[5]，在L-Glu和Aβ25-35 损伤两种细胞模型观察到了同样的作用，而且明显提高细胞存活率，进一步证实了梓醇的胆碱能神经保护作用，可以认为梓醇就是中药地黄治疗衰老和老年痴呆的主要活性成分。但是其既不是胆碱酯酶抑制剂，也不是M受体激动剂或阻断剂[5]，迄今机制不明。
本研究用K252a进行了深入探讨。K252a[6]是神经营养因子(NTF)高亲和力trk(tropomyosin-related receptor kinases)受体的特异性阻断剂，而NTF如NGF、BDNA等主要与trk受体结合维持神经元的功能及存活等，因此K252a可阻断NTF-trk作用途径，取消NTF对神经元的保护作用。
结果发现加入K252a干预后，梓醇升高PC12 细胞模型M受体密度作用减弱： Aβ25-35 损伤的细胞，高浓度梓醇仍呈现上调M受体作用，与同浓度梓醇单纯作用组无显著差异，仅低浓度梓醇作用消失；K252a对梓醇升高L-Glu损伤PC12 细胞M受体密度的影响更明显，K252a干预后梓醇的作用显著减弱，比单纯梓醇作用显著下降，这说明梓醇神经保护作用机制至少部分与NTF-trk途径有关，但由于K252a对NTF受体的亚型trkA、B、C无选择性，尚待研究确定梓醇作用具体与哪条途径有关。
K252a对梓醇保护L-Glu和Aβ25-35 损伤PC12细胞的作用出现了差别，对保护L-Glu损伤的阻断作用明显增强，说明梓醇对L-Glu和Aβ25-35损伤PC12细胞保护作用机制存在差异，分析可能的原因有：①Aβ和L-Glu对细胞毒性作用机制不同。Aβ毒性的可能机制有Aβ离子通道假说、Aβ-膜受体作用假说及氧化应激等[7]，而Glu通过与其特异受体主要是NMDA受体结合影响Ca��2+�内流损伤神经元[8];②NTF家族中，BDNF的功能与AD发病的关系更加密切，已经证实AD患者脑内BDNF含量明显减少，其调节突触可塑性及与记忆、认知相关的海马LTP功能降低，产生学习和记忆功能缺失。BDNF及其高亲和力受体trkB定位于谷氨酸能神经突触，其神经调节作用与谷氨酸NMDA受体功能相关联[9]，K252a阻断BDNF-trk作用途径可能对L-Glu的细胞毒作用产生了一定影响，有待深入探讨。
参考文献
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