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[摘要]目的：建立乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)垂直传递的小鼠模型，探讨HBV垂直传递的机制。方法体外培养小鼠精细胞，阳离子转染剂介导HBV DNA转染精细胞，应用聚合酶链反应(PCR)检测小鼠精细胞中HBV DNA的存在，并使用荧光原位杂交技术(FISH)观察HBV DNA在精细胞中的定位；采用精子载体法建立HBVDNA垂直传递小鼠模型，应用PCR和半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测新生代小鼠中HBV DNA的存在及表达。结果：PCR检测到被转染的精细胞中有HBV DNA的存在，并且荧光显微镜下部分精子带有黄绿色阳性杂交信号，主要在精子头部的中后部区域两侧和顶部；31只新生代小鼠中11只小鼠检出HBV DNA，其中又有3只检出HBV RNA。结论为研究乙肝病毒垂直传播的机制建立了理想的HBV DNA垂直传递小鼠模型。
[关键词]乙型肝炎病毒DNA；垂直传递；转染；精子
[中图分类号]R512.62；R321.1 [文献标识码]A [文章编号]1671―7562(2007)05―0361―04
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的世界上广泛流行的传染病，严重危害人类的健康。垂直传播是HBV感染的重要传播途径之一，在各种不同发育阶段的生精细胞及成熟精子中均可检出HBVDNA，Blumberg曾推测HBV的垂直传播可能是由于HBV DNA整合入宿主生殖细胞基因中，然后在子代中传播。为探索HBV传播给下一代的途径，我们检测了精细胞对HBV DNA的俘获性并建立了HBV DNA垂直传递小鼠模型。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 动物
青岛大学医学院动物饲养中心饲养的昆明系性成熟小鼠32只，其中有20只雄鼠用来做精子俘获实验；有6对(雄性6只，雌性6只)小鼠用来做动物模型。
1．1．2 外源基因PBR322-HBV DNA(包含HBV全长DNA序列)
由黄天华教授馈赠，大肠杆菌JM109扩增。
1．1．3 试剂
梭华-SofastTM基因转染试剂购自厦门太阳马生物工程有限公司；HBV DNA FISH试剂盒购自天津市灏洋生物制品公司；PCR试剂均购自上海生工生物工程公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成；RT-PCR试剂盒购自Promegar试剂公司；质粒提取纯化试剂盒购自北京天为时代生物公司；精细胞培养液M2自行配制。
1．2 方法
1．2．1 精子俘获外源HBV DNA的实验检测
1．2．1．1 梭华-SofastTM基因转染试剂／HBV DNA复合物的制备 质粒HBV DNA PBR322加入10μl DMEM轻轻混匀，按说明书加入梭华-SofastTM基因转染试剂，复合物室温孵育18min。
1．2．1．2 小鼠精子的采集及转染。取性成熟的雄性昆明系小鼠，处死后取出附睾，置入37℃预温的M2培养液中，待其液化，一式两份：(1)1份于CO2培养箱内获能培养1.5h，将转染复合物按比例滴加入获能后的精子悬液中，混匀后共同孵育40min，对照组不滴加复合物；(2)另1份用PBS洗涤后置4℃冷处理24h，镜下观察精子已完全丧失活动确定其死亡后，按上述活精子的实验步骤处理。
1．2．1．3 精子活力评估。用血球计数板计数第1份精液中精子转染前后的不活动精子数，计数500个精子，以评估精子的活力。
1．2．1．4 转染后精子的洗涤及外源DNA的消化。将孵育后的精子用预温的M2液洗涤充分洗涤8次，每次10min，8000 r・min-1离心，尽量吸去上清(最后1次的洗涤上清留作阴性对照)；加入DNase 100μg・ml-1，37℃作用1h，消化精子外膜黏附的外源DNA。8000r・min-1。离心两次除去DNase，M2液重悬精子细胞沉淀。
1．2．1．5 精子细胞的荧光原位杂交。精子悬液8000r・min-1。离心取沉淀，使用新鲜配置的固定液(甲醇：冰醋酸3：1)固定，调浓度为1×106个・ml-1，滴冰玻片，自然风干，取片龄1周(老化)的滴片乙醇梯度脱水，参照试剂盒行原位杂交，荧光显微镜观察后再行DAB显色，封片光镜观察。
1．2．1．6 精子细胞DNA提取。从第1份精液精细胞中提取DNA：重悬后细胞离心去上清，消化缓冲液HMV3.94ml、蛋白酶K20μl、10％SDS 40μl裂解精细胞，等体积的酚：氯仿抽提DNA，TE融解。
1．2．1．7 PCR扩增检测HBV DNA。所用HBV DNA引物对应HBV基因组1767～1787bp合成，目的片断长301bp，上游5′-TIT GTA CTA GGA GGC TGT AGG-3′，下游5′-CTG AGT GCC GTA TGG TGA-3′。
1．2．2 经输精管精子载体法转染HBV DNA建立垂直感染小鼠模型
1．2．2．1 输精管及附睾管内精细胞转染外源HBV DNA制备转染活体小鼠所需转染液：5％葡萄糖+SofastTM，5％葡萄糖+PBR322-HBV。小鼠麻醉后腹中线两侧切口，将转染试剂(0.04％的苔盼蓝作指示剂)注入6只小鼠的输精管内，每侧注入50μl。复位后手术线缝合，抗生素少量涂抹患处。
1．2．2．2 提取幼鼠鼠尾DNA，PCR扩增检测HBV DNA 6只雄鼠分别与雌鼠合笼饲养10d后分笼，待雌鼠生出下一代。提取幼鼠鼠尾DNA，PCR扩增检测HBVDNA，所用HBV DNA引物对应HBV基因组1852-2167bp合成，目的片断长316bp，上游5′-TCA TGT CCTACT GTF CAA GC-3′，下游5′-CCT TAA TCA TCA GCCGAT AC-3′。
1．2．2．3 RT-PCR检测HBV DNA在幼鼠体内的基因表达．Trizol抽提HBV DNA检测阳性的小鼠鼠尾RNA。RT-PCR所用引物对应HBV基因组1828～2363bp合成，目的片段长536bp，上游5′-CAC CTCTGC ETA ATC ATC TC-3′，下游5′-CAA CAA TCT GCTTCT CCG TC-3′；使用小鼠GAPDH作为内参照基因，目的片段长575bp，上游5′-TGT TCC AGT ATG ATT CTACCC A-3′，下游5′-GGT AGG AAC ACG GAA GGC-3′。
1．3 统计学处理
结果的比较采用Pearson x2检验。
2 结果 2．1 转染前后精子活力评估
倒置显微镜观察转染前后活动精子个数的变化，计数板计数，随机选取精子个数800个以评估精子活力，转染前活动精子677个，占84.6％，转染后活动精子688个，占86％，转染前后精子活力差异无统计学意义(P>0.05)。
2．2 精子中HBV DNA的存在
以与梭华SofaslTM基因转染试剂／HBV DNA复合物共培养后的精子DNA提取物为模板进行PCR扩增，结果见图1，2～5泳道精子样本的扩增产物在301bp处有明显条带，与阳性对照条带(泳道6)一致。
2．3 HBV DNA在精子中的定位
荧光原位杂交后荧光显微镜下观察，精子样本中部分精子带有阳性黄绿色杂交信号，阳性杂交信号位于精子头部的中后部区域两侧和顶部；荧光原位杂交后再经DAB显色，普通光镜下观察，阳性杂交信号为黄褐色颗粒，基本位于相同位置。对照组经DAB显色后，普通光镜下观察，无信号存在或只呈现本底水平染色，死精子经DAB显色后与对照一致。
2．4 精子细胞原位杂交结果的统计学分析
在高倍镜下观察转染和未转染HBV DNA的精子细胞涂片，随机选取视野计数500个精子，统计携带PBR322一HBV DNA的精子数目，转染组荧光原位杂交信号的阳性率为49.2％(246／500)，阴性对照组阳性率为2％(10／500)，二者差异有统计学意义(x2=292.40，P2=209.00，P
