【www.zhangdahai.com--自查自纠报告】
【摘要】 Smac Smacl Second mitochondrical activator of caspase是一种新发现的线粒体蛋白，在细胞凋亡过程中起着重要作用；当细胞发生凋亡时，其与细胞色素C一起被释放进入细胞浆，在细胞色素C/Apaf-1/Caspase-9凋亡途径中促进Casepase(含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶)的激活。Smac通过解除凋亡抑制蛋白对Caspase-3、Caspase-7、Casepase-9的抑制作用而诱导细胞凋亡。Smac的高表达可以增加细胞对凋亡刺激信号的敏感性，这对于肿瘤的发生、发展，以及肿瘤的治疗具有重要意义。�
【关键词】肿瘤；凋亡；Smac；Casepase
细胞凋亡(Apoptosis)又称程序性细胞死亡(Programmed cell death)，是生理性细胞死亡过程，对机体的发生、发展，以及自身稳定起着关键性作用。含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶(Casepase蛋白酶)家族是细胞凋亡的中心环节[1]。细胞凋亡受抑，将导致细胞生存期延长，有利于转化突变的细胞生长积聚，最终可致肿瘤的产生。细胞凋亡存在内源和外源两条通路，也分别称为死亡受体通路和线粒体通路[2]。在细胞受到各种凋亡刺激(包括抗癌药物、紫外线照射、化学信号、DNA 损伤等)时,线粒体蛋白Smac(second mitochondrial activator of caspase，又称 DIABLO，direct IAP binding protein with low PI)的线粒体定位信号肽被切除,形成有活性的Smac蛋白释放入胞浆中,此时的Smac 蛋白可以特异结合IAP(如XIAP),解除IAP 对于caspase-3、caspase-9 等的活性抑制作用,从而促进凋亡[3]。
1 Smac的一般性状�
Smac是由Wang 等首次报道的[4]，他们从HeLa 细胞中分离出一种新型线粒体蛋白质， 命名为第二个线粒体衍生的半胱氨酸蛋白酶激活剂(second mitochondria-derived activator of caspase,Smac)。几乎同时,Vaux 等发现，从293 T 细胞中分离出一种低等电点(PI)的IAP 直接结合蛋白(IAP binding protein with low pI,Diablo)。经对比分析，Smac 与Diablo 完全等同[5]。免疫分析结果显示Smac定位于线粒体，在凋亡信号刺激下与细胞色素C(cyto C)一同从线粒体释放到细胞质，与IAP 结合抑制其抗凋亡活性从而实现增强凋亡。�
人类的Smac基因定位于12 号染色体长臂，由7 个外显子组成，编码Smac 全长的cDNA 共719 bp，编码239 个氨基酸，估计分子量27 KD，pI 为6．5；Smac mRNA全长约1．5KB，编码239 个氨基酸的开放性阅读框，其为最初合成的前体蛋白，分子量约为27 KD。结构分析发现，Smac的氨基端的1~55 位氨基酸是一个典型的线粒体定位序列(mitochondrial targeting sequence,MTS)，它是由两性肽段构成α螺旋，肽链一侧带阳性电荷(Arg-10、Arg-17、Arg-19、Lys-31、Lys-32、Arg-33、Arg-40)。该肽段在移入线粒体后被切除，融合到GFP(green fluorescent protein ，绿色荧光蛋白)，融合后能准确定位于线粒体。含有M TS 的Smac是前体分子，它不与IAP 结合，确保未成熟的Smac在胞浆转运中无促凋亡活性；进入线粒体后M TS 被切除，形成成熟的Smac，也称为野生型的Smac；成熟的Smac包含184个氨基酸，分子量约23KD，pI 约5．3；而在鼠类全长的Smac分子量约为29 KD，pI约6．1。�
Smac单体分子的空间构型是一种有适度弯曲拉长的三螺旋结构；H1 螺旋紧挨H2 和H3 ，而H2 和H3 是分离的；多数疏水残基位于三螺旋的内部，起着稳定螺旋结构的作用。 另外，暴露的极性残基侧链形成23 个螺旋内氢键，以及9 个螺旋间氢键。H1 氨基端一半和H2 羧基端1/3 构成的一个表面区域，聚集的疏水残基约占了暴露的疏水残基的一半；表明该区域可能是重要的蛋白质结合区。成熟的Smac在水溶液中以对称二聚体结构存在， 两个单体通过H1 与H2 构成的疏水区相连成“锚形”，氨基端在上，羧基端在下，单体间夹角约115°，空间构型为长13 nm ，宽3．5 nm ，高6．5 nm。
2 Smac的组织定位�
用Smac抗体对存活细胞进行免疫染色，发现一种呈现点状分布的线粒体定位；同细胞色素C一样，在受到紫外线照射后Smac从斑点状变为胞浆溶解状，此时该细胞通过DAP1染色出现染色体聚集；同时发现前体Smac局限于线粒体膜上，成熟的Smac在线粒体膜上和细胞浆中均存在；主要原因是前体Sma在活细胞中存在于线粒体内，成熟的Smac存在于线粒体膜间隙，在凋亡刺激因素作用下Smac可以从线粒体膜间释放入胞浆，参与凋亡调节。实验显示，内源性的Smac在N T2 细胞未受到紫外线照射时集中存在于线粒体膜上，受到紫外线照射后释放入胞浆，同时与IAP 作用，表明Smac 的促凋亡活性取决于其定位而不是加工。另外，Smac在正常细胞不诱发凋亡，仅在受损细胞起作用[6]。Smac 在不同组织表达各不相同：在成人的睾丸表达水平最高，在心脏、肝脏、肾脏等也有较高的表达，在脑、肺脏、胸腺，以及在外周血中为低表达。在鼠类的分布与人类基本相同。 Smac 的mRNA 在肿瘤细胞中广泛表达[7]。
3 Smac的作用
3．1 Smac对神经细胞的作用 Smac在神经变性以及中枢神经系统病理发生中起重要作用。体外研究证明：Smac能抑制少突胶质神经细胞的凋亡并可逆转其有丝分裂后已分化的表型；在无血清培养条件下，少突胶质神经细胞主要通过线粒体途径凋亡。Smac一方面抑制caspase-3，caspase-9 的活化；另一方面又活化PI3-k/Akt 信号通路，引起Bad 在其112 和136 位上丝氨酸残基的磷酸化，进而导致Bad 从Bad/Bcl-xL 复合物上脱落；其结果减少了线粒体内膜细胞色素C 的释放,进而抑制少突胶质神经细胞中线粒体的凋亡；在一些炎症性脱髓鞘疾患中，这一机制可能促进少突胶质神经细胞的存活[8]。另外，Soane 等报道：Smac除了抑制caspase-3 的活性,还能够增强Bcl-2 的合成，从而使少突胶质神经细胞免于凋亡；对于血旺细胞(Schwann)Smac能够激活其细胞周期，进而细胞增生而免于凋亡[9]。利用6 日龄鼠坐骨神经血旺细胞体外研究表明：Smac是通过活化PI3-1/Akt 信号通路，使Bad发生磷酸化(在136 位丝氨酸残基上)， 以及增强Bcl-xL 蛋白的表达，而使血旺细胞免于凋亡的。体内炎症性神经病变时发现，血旺细胞上的Smac可能通过促进血旺细胞的再髓鞘化而使其存活下来[10]。
3．2 Smac对心肌细胞的作用 Smac能引发保护性的细胞反应而不致细胞死亡。体外培养研究结果表明，Smac可引起人类主动脉平滑肌细胞和内皮细胞的活化，增生。对MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)路径的分析揭示，ERK-1、JNK-1(Jun N末端激酶)和MAPK等激酶都被Smac活化。内皮细胞膜上的Smac也能够活化JAK-1(Janus 激酶)以及信号转导因子和转录激活因子STAT-3，4，进而启动一些相关基因的表达。现有证据证明：补体系统的活化在动脉粥样硬化的慢性炎症进展中，起着重要作用[11]。利用新西兰白兔离体心脏研究表明：非杀伤性补体激活，能够显著减少因局部缺血造成的梗死面积；但结果提示，这种情况下补体是通过C5a 的形成而起作用的。进一步研究提示，由免疫球蛋白介导的补体缓慢活化而产生的Smac对充血性心肌病的发展，可能起着一定程度的促进作用。经过对28 位充血性心肌病患者心肌组织活检的分析证实：心肌细胞上有C5b-9 复合物的沉积，并且与免疫球蛋白的沉积、心肌细胞TNF-α的表达，有明显的相关性；但在本病的进展中，TNF-α起着重要作用[12]。
3．3 Smac对血液细胞的作用 利用人类白血病K562 细胞研究证明：细胞能被亚裂解量的C5b-9 脱敏而抵抗溶破剂量的补体破坏作用，称之为补体诱导的保护作用；这一过程需要Ca�2+的内流、PKC 的活化以及一些相关蛋白的合成；该过程涉及一系列信号的级联反应，包括PKC介导的ERK 及M E K-1 的激活[13]。Kraus S[14]等的研究结果表明：经sMAC 处理过的K562 细胞能够在50 min内抵抗溶破剂量的补体攻击(即脱敏desensitization)；钙离子载体或豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)，能迅速诱发K562细胞抵抗补体的破坏作用，以及一种类似于补体诱导的大分子蛋白复合物(L-CIP)的合成；而PKC 抑制剂如GF109203X 或Go6976 能抑制上述结果的发生；对K562 细胞的免疫荧光技术分析证实，sMAC 能引发PKC-α和PKC-β由胞浆向浆膜转移；这些结果提示，在sMAC 或钙离子载体诱导的细胞脱敏反应中，PKC的活化是其早期必不可少的信号。在人类特发性血小板减少性紫癜，经血小板抗体诱生的sMAC 可导致血小板微粒的产生，并且与复合物本身的浓度相关联。进一步的分析还表明[15]，在男性与女性以及个体患者之间，机体对C5b-9 复合物破坏血小板的抵抗力有很大差异，并且血小板微仍保留其止血功能。
3．4 Smac对肾脏细胞的作用 Pippin Jw等在研究Smac对大鼠被动性黑曼氏肾炎(PHN)模型的影响时,将足细胞乳酸脱氢酶的释放量，低于其全溶时释放量的5%时的C5b-9作为Smac的浓度；结果发现：Smac 引起足细胞DNA 损伤的增加，并且是C5b-9 复合物依赖性的；此时，P53、P21waf-1、GADD45、和限制点(Checkpoint)激酶-1、2 等细胞周期蛋白，以及ERK(细胞外信号调节激酶)-1、2 的表达增强，并且ERK能降低足细胞DNA 损伤的程度；这可能是这类肾病时足细胞增殖受到限制的原因。与正常肾小球上皮细胞比较，Smac诱发的大鼠肾小球上皮细胞表达Cox(环氧合酶)-1 ，-2,前列腺素P GE(2)也增高约一倍。另外，Smac引起体外培养的肾小管上皮细胞内Ca�2+、cAMP的增高,，继而引起纤维连接素(fibronectin)mRNA 的大量增加及其蛋白积聚。这为解释某些肾病时肾小管上皮病理改变的机制提供了新的依据。
3．5 Smac对其他组织细胞的作用 Smac沉积在类风湿关节炎组织中,并促进IL-8、TNF-α等前炎症介质的表达。有研究显示：无论体内外Smac在IgG 免疫复合物的辅助刺激下，鼠肺泡巨噬细胞可产生C-X-C(巨噬细胞炎性蛋白-2 和细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子)和C-C(巨噬细胞炎性蛋白-1α和单核细胞趋化因子)等趋化因子；但若没有辅助刺激物(IgG 免疫复合物)的存在,，则无此结果；在前一种情况下，则可见到继发性中性粒细胞聚集增多以及肺泡损伤，说明Smac在变应性肺炎的病理发生中起部分作用。
4 Smac的作用机制�
成熟Smac 在细胞发生凋亡时，与细胞色素C共同释放入细胞质，通过逆转IAP 的作用而实现其促凋亡作用；它可作用于受体介导和线粒体两种途径。在细胞色素C-Apaf-1-caspase-9 凋亡途径中可结合BIR3、BIR2，并可作用于caspase-9、caspase-3 以消除IAP 对它们的抑制。Smac 与BIR2 结合可以使caspase-7 剥离且被激活，caspase-7 则去降解其他IAP 以此推进凋亡进展。并且凋亡细胞中过表达的Smac 能增强肿瘤瘤细胞对凋亡信号刺激的敏感性，这些都将促进细胞凋亡的进展。在受体介导的凋亡途径中Smac 也是必不可少的。它能调节caspase-3 的活性来激发凋亡的发生、发展。另有研究发现：Smac 可促进化疗药物及TRAIL 诱导的凋亡，对肿瘤的治疗有重要的意义。
5 Smac在肿瘤中的表达�
Yoo等应用免疫组织化学方法分析Smac在肿瘤中的表达情况，结果显示：Smac在癌症中的表达率为62%，其中包括胃癌42/60，结肠癌7/10，肺癌4/10，卵巢癌7/10，前列腺癌2/10；在肉瘤中表达率为22%，其中包括恶性神经鞘病2/8，横纹肌肉瘤5/11，恶性皮肤纤维瘤2/7，平滑肌肉瘤1/6，尤因肉瘤1/2，8例血管肉瘤和8例脂肉瘤中均无表达。表明，Smac在不同的癌症组织中的表达不同，提示低表达Smac可能抑制肿瘤细胞凋亡。�
Smac在肿瘤中的高表达可促进肿瘤细胞凋亡，并增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。Jia等将含有全长(FL)和成熟片段(MT)的Smac 基因转染入K562 和CEM 细胞系中并使之稳定表达，结果FL 和MT Smac 转染子均可增强紫外线诱导的凋亡的敏感性，并活化caspase-3 和caspase-9。这可能是由于过表达的Smac 解除了XIAP 和Survivin 对癌细胞增生的促进作用。�
Kominsky等[3]研究呼吸肠道病毒诱导的HEK 细胞凋亡通路时发现，呼吸道病毒感染可以诱导caspase-8 的活化，以及凋亡蛋白前体bid 的裂解，这些事件能够促进Smac 及CytoC 从被感染细胞的线粒体释放，而且这些蛋白的释放能够被过表达的bcl-2 阻抑。释放到胞质中的Smac阻止了XIAP、survivin 及cIAP1 的抗凋亡作用，诱导caspase-3(起始caspase 及效应caspase)的持续活化。 而在此过程中同样被活化的caspase-9被认为是可有可无的。 �
Gorka等用3 种方法在喜树碱(CPT)诱导的MCF-7 乳腺癌细胞凋亡研究中发现，Smac的释放与bax(bid)在线粒体外膜上的大量汇集，及线粒体的通透性转换孔的开放有关，与bax 和bid 激活有关的酶m-Calpain 和caspase-8 能够阻止Smac 的释放与传播，从而阻断CPT 诱导的MCF-7 细胞凋亡；并且该研究表明CPT 处理引起的Smac 蛋白从线粒体释放的同时伴有CytoC 的释放。Schliep等在研究IAP 与慢性淋巴细胞白血病的关系时证明，高表达的Smac能够有效的克服IAP 对caspase 的抑制作用。 �
Mendoza等在研究MEKK1 诱导的人肾胚胎细胞凋亡时发现，MEKK1 活化后从线粒体膜间没有释放出CytoC， 而引起了Smac从线粒体释放，进而证明其与MEKK1 诱导的凋亡相联系；通过RNA 干扰技术降低Smac 的表达，导致MEKK1 诱导的细胞凋亡显著下降；而在鼠的胚胎原纤维细胞中，MEKK1 表达缺失，能够抵抗鬼臼乙叉苷(etoposide)导致的Smac释放；然而etoposide 导致的线粒体CytoC 的释放并未被阻止；并且MEKK1 诱导的线粒体蛋白Smac 释放不受MEKK1 介导的JNK 活化的影响，提示Smac的释放在MEKK1 诱导的凋亡中占有很重要的地位。�
Fulda等研究发现在化疗药物或是凋亡诱导因子TRAIL 诱导下，转染了Smac的神经母细胞瘤细胞凋亡率，较未转染Smac的瘤细胞明显上升，而对于正常细胞没有影响。Hunter等研究表明Smac不能诱导健康的细胞凋亡，但是对于含有过量Smac的细胞，使其对凋亡促进药物的敏感性大大加强，并且耐药性大大降低。
6 Smac的抗肿瘤作用
6．1 Smac通过影响肿瘤细胞的生长周期发挥抗肿瘤作用 Li等将全长的Smac 基因和成熟的Smac 基因，转染到人类白血病CEM 细胞中，构建成C/FL 和C/MT 细胞，经5 溴-2 脱氧尿苷(BrdU)介入，和DNA含量分析CEM、C/FL 和C/MT 三种细胞，发现Smac 能有效地阻滞瘤细胞于G0/G1 期。这可能是Smac 消除了XIAP 和Survivin 促进癌细胞增生这一作用的结果，因为XIAP 和Survivin 与癌细胞的增殖具有密切的关系。这也表明Smac 能通过影响肿瘤细胞的生长周期发挥抗肿瘤作用。因此，用Smac 与周期特异性药物联合，治疗肿瘤可能取得良好的疗效。大蒜素是当前研究比较热的一种抗肿瘤药物，它能通过下调BcL-2， 降低端粒酶的活性从而将癌细胞阻滞瘤细胞于G2/M 期。同时有研究发现，BcL-2 具有很强的阻碍Smac 释放的功能。因此，将Smac 与大蒜素配合治疗肿瘤，可能是一种非常有效抗肿瘤的方法。
6．2 Smac通过增强肿瘤免疫力发挥抗肿瘤作用 Li构建了eGFP-Smac 融合蛋白(pro-Smac)，并将其引入免疫原性差的实验鼠黑色素瘤细胞(D5 细胞)中；每种eGFP-Smac 融合蛋白包含了Smac ，和独特作用于端粒(GrB)和caspase-8 的裂解位点，使其能作用于CTL 和NK 细胞；pro-Smac 极大的增强了D5 细胞对LAK 细胞杀伤肿瘤细胞的敏感性；表达eGFP-Smac 融合蛋白的肿瘤细胞，对于由GrB 诱导的杀伤肿瘤的作用而言，含有GrB 裂解位点，比含有caspase-8 的裂解位点具有更强的杀肿瘤细胞的能力。这些结果表明：Smac 能增强细胞毒细胞的杀伤肿瘤细胞的作用，从而发挥其抗肿瘤的作用。
6．3 Smac通过其羧基末端促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用 Darren等构建了Smacβ(一种去除了线粒体靶序列的丧失了结合IAPs 的能力Smac)并让其表达于MCF-7 细胞质中，结果发现：Smacβ增强了两条凋亡途径所诱导的MCF-7 细胞凋亡。他们认为：这可能是Smac 的羧基末端的功能区作用于两条凋亡途径的共同点所致，也很可能Smac 的羧基末端的功能区通过增强凋亡小体的形成和活化，进而提高了caspase 后线粒体的活化水平所致。这一结果暗示，Smac 除了能通过其氨基末端促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用外，还能通过其羧基末端促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。当前大多数学者都认为，Smac的氨基末端结合IAPs 是发挥其促凋亡功能的最主要的原因，而对这一机制缺少深入研究。对这一抗瘤机制的进一步研究有助于我们更全面更深入地了解Smac。
6．4 Smac通过其氨基末端促进细胞凋亡发挥抗肿瘤作用 目前细胞凋亡的途径主要有两条，即线粒体途径和死亡受体途径。这两条凋亡途径的起始和终止都需要Caspase 的参与，Caspase 包括一连串的始动Caspase 和效应Caspase ，Caspase-9 是线粒体凋亡途径的始动Caspase ，Caspase-3 和Caspase-7 是两者共同的效应Caspase 。凋亡抑制蛋白(IAPs)正常情况下与caspase 结合使其丧失活性，从而抑制细胞凋亡。IAPs 家族含有一个到三个能与Caspase 结合的BIR 功能区。Smac 在细胞受到各种凋亡刺激时(包括抗癌药物、紫外线照射、化学信号、DNA 损伤)从线粒体中释放出来与IAPs 结合，解除IAPs 对Caspase的抑制作用，进而促进细胞凋亡。
7 结语�
综上所述，Smac是一种新发现的线粒体蛋白，在细胞凋亡过程中起着重要作用；当细胞发生凋亡时，其与细胞色素C一起被释放进入细胞浆；Smac通过解除凋亡抑制蛋白对Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9的抑制作用而诱导细胞凋亡；Smac 能通过多种抗瘤机制发挥其抗肿瘤作用。可以预见,应用Smac及由它衍生而来的小分子肽必将成为未来肿瘤治疗的一个新举措。 �
参 考 文 献
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