【www.zhangdahai.com--个人述职报告】
［摘要] 目的 观察血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)卡托普利 (captopril, CAP)对白蛋白引起的肾小管上皮细胞表达ACE、 ACE2及其作用产物Ang Ⅱ的影响。 方法 实验分组：对照组（未干预的人近端肾小管上皮细胞株，HK-2）；牛血清白蛋白（BSA）组(10�mg•ml-1)； CAP组(10�μmol•L-1)；BSA加CAP组。分别采用实时定量RT-PCR和Western Blot检测ACE、ACE2 mRNA和蛋白的表达水平；采用放射免疫法(RIA)检测细胞上清液中Ang Ⅱ的浓度。 结果 实时定量RT-PCR显示，与对照组比较（相对表达量为0）， CAP组ACE mRNA表达差异无统计学意义（0.27±0.09 vs 0，�P>0.05）；CAP能显著抑制BSA引起的ACE mRNA表达上调[（BSA+CAP）组∶BSA组为（0.80±0.05） vs （1.58±�0.20），P
既往研究表明，肾脏局部肾素-血管紧张素系统 (intrarenal renin angiotensin system, RAS)的激活在慢性肾脏病 (chronic kidney disease, CKD) 的发生发展中可能起重要作用［1］。Largo 等［2］研究发现，白蛋白是导致肾脏局部RAS激活的重要因素。最近研究显示，局部血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)的产生既依赖于血管紧张素转换酶 (angiotensin-converting enzyme, ACE)的激活，也与ACE2活性降低导致Ang Ⅱ降解减少有关［3］。卡托普利 (captopril, CAP)作为第一个问世的血管紧张素转换酶抑制剂 (angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEI)，临床及实验均证实其具有降压、降低蛋白尿从而延缓CKD进展的作用，然而它对肾脏细胞ACE/ACE2表达的影响如何文献报道不多。本研究旨在观察CAP对白蛋白引起的肾小管上皮细胞（HK-2）ACE、ACE2及Ang Ⅱ表达的影响。�
1 材料与方法�
1. 1 细胞培养�
HK-2细胞株为人近端肾小管上皮细胞 (human proximal tubular cells, HPTCs)的永生系，保持了HPTCs基本的生物学特性，由Aled Phillips教授 (Cardiff, UK)惠赠。培养基成分包括低糖型DMEM培养基 (Gibco公司)、10%新生牛血清（FCS，杭州四季青生物工程公司）、HEPES (Sigma公司) 2.38�g•L-1、碳酸氢钠3.7�g•L-1、青霉素1×10�5�U•L-1、链霉素100�mg•L-1，氢化可的松0.4�μg• ml-1、转铁蛋白5�μg•ml-1、胰岛素5�μg•ml-1。用0.25%胰酶消化后，按照2×10�5ml-1细胞接种于六孔板。80%～90%融合时改为无血清DMEM培养�24�h，使其生长同步后进行实验。各组细胞数及培养液体积均相等。 �
1.2 实验分组�
对照组 （未干预的人近端肾小管上皮细胞株HK-2）；牛血清白蛋白组 (bovine serum albumin, BSA) (10 mg•ml-1, 12 h)；CAP组(10 μmol•L-1预处理�1 h)；BSA加CAP组。�
1.3 实时定量反转录PCR (Real time RT-PCR)�
按照TRIzoL RNA提取液（凯基公司，KGA1203）说明书步骤，应用氯仿-异丙醇法提取细胞总RNA。所提取的RNA溶于DEPC水处理过的双蒸水中。用紫外分光光度计测260、280 nm吸光度, 计算A��260 nm /A��280 nm值。取2 μl总RNA，按照反转录试剂盒 (Takala公司)说明书操作合成cDNA。引物均由Takala设计合成，见表1。�
采用Real-Time PCR 扩增仪 (Lightcycle，Roche)进行PCR反应。按下列条件进行扩增：95�℃预变性10�s， 95�℃变性10�s→60�℃退火20�s→68 ℃延伸�1�min，循环35次。应用比较阈值法，根据数学方法推导得出，目的基因量＝2-ΔΔCt，在该公式中，Ct是荧光达到荧光阈值的循环数，ΔΔCt＝(Ct��目的基因－Ct��管家基因)��实验组－(Ct��目的基因－Ct��管家基因)��对照组，使用这一方法能直接得到目的基因相对于管家基因的定量［3］，比较目的基因与对照组基因比值的常用对数。�
1.4 Western 印迹�
按照细胞总蛋白抽提试剂盒（凯基公司，KGP2100）说明书步骤提取细胞总蛋白。冰PBS清洗1或2次，弃去PBS，按照200�μl•孔-1加入蛋白裂解液（含0.1%蛋白酶抑制剂、0.5%PMSF、0.5%磷酸酶抑制剂）。冰浴条件下进行匀浆；离心（4�℃，10�000�r•min-1）10�min，去除沉淀，留取上清。采用bradford蛋白质定量试剂盒（凯基公司，KGA-801）检测蛋白含量。制备10%分离胶和5%积层胶，每孔上样量为50�μg，使用BIO-RAD电泳装置，进行SDS-PAGE电泳（120�V电泳30�min后80�V电泳90�min）。100 V 恒压湿转膜1.5�h，TBST配制的5%脱脂牛奶室温封闭1�h，加一抗（羊抗ACE多克隆抗体，Santa Cruz）1∶500稀释，4�℃过夜。次日TBST洗膜3次，每次5�min，再加二抗（HRP标记的兔抗羊IgG）1∶3 000稀释，室温孵育1�h，TBST 洗膜3次，每次5�min。ECL显色(Ameresco)，胶片扫描后用Quantity One软件分析灰度值，并计算与β-actin的比值。�
1.5 放射免疫法检测上清液中Ang Ⅱ浓度�
将细胞悬液（约1×10�5�ml-1）接种到24孔板中培养（方法和分组同上）。每组设6个复孔，终末容积400�μl•孔-1。分组干预后收集细胞上清液300 μl•孔-1，用Ang Ⅱ放射免疫试剂盒（北京北方制药公司）直接测定，具体操作方法严格按说明书进行，所有标本行同一批检测。�
1.6 统计学方法�
实验所得数据结果均以x- ±s表示，多组间资料比较用方差分析，两组间资料比较用t检验。使用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。�
2结果�
2. 1 总RNA纯度鉴定�
A��260 nm /A��280 nm值在1. 8～2. 0之间，说明RNA纯度高。�
2. 2CAP对BSA引起ACE mRNA表达的影响�
实时定量RT-PCR显示，与对照组 （相对表达量为0）比较， BSA组ACE mRNA 表达水平显著增加 �(1.58±0.20 vs 0, P0.05)（图1）。�
2.3 CAP对BSA引起ACE2 mRNA表达的影响�
与对照组比较，BSA (10�mg•ml-1)作用12�h后，ACE2 mRNA 表达显著减少 (-1.35±0.13 vs 0, P0.05)（图2）。�
2.4 CAP对BSA引起ACE/ACE2蛋白表达的影响�
Western blot 显示的ACE、ACE2和actin的蛋白表达情况，见图3。BSA作用12 h后ACE蛋白表达较对照组显著增加（1.2±0.10 vs 0.52±0.05，P0.05) （图4A）。与此同时，BSA作用12�h后ACE2蛋白表达较对照组显著降低（0.35±0.09 vs 1.13±0.11，P0.05）（图4B）。�
2.5 CAP对BSA引起Ang Ⅱ浓度的影响�
RIA结果显示，与对照组比较，BSA可显著增加细胞上清液中Ang Ⅱ 的浓度[(97.25±10.4) vs (28.53±�3.5) �pg•ml-1，P0.05]（图5）。�
与对照组比较, #P0.05�
图5 卡托普利对白蛋白引起HK-2�
细胞上清液AngⅡ浓度的影响�
3 讨论�
ACEI是最早应用于临床的RAS阻断剂，AIPRI (The angiotensin-converting-enzyme inhibition in progressive renal insufficiency study) ［4］和REIN(Ramipril efficacy in nephropathy) ［5]研究均证实，ACEI不仅可以降低血压，而且可以减少蛋白尿，从而延缓慢性肾脏病的进展。肾功能正常或轻度损害的IgA肾病患者应用福辛普利一年可使蛋白尿减少36%，而7年肾存活率达92%［6］，在非糖尿病性微量白蛋白尿患者，福辛普利也被证实可非降压依赖性地降低微量蛋白尿［7］。最近不少研究提示，蛋白尿本身就是一种肾脏毒素，会导致肾组织局部RAS激活，参与肾小管间质纤维化的形成 ［8］。ACEI的肾保护作用是否与其通过抑制蛋白尿，进而抑制肾脏局部RAS激活是一个值得探讨的问题。�
近年来越来越多的研究表明，肾脏存在独立于系统RAS的局部RAS，而局部RAS的激活在CKD的进展中发挥主要作用 ［9］。Ang Ⅱ是局部RAS最主要的效应因子，通过促进细胞产生生长因子、趋化因子及炎症因子等参与纤维化的进程 ［10］。而蛋白尿的肾毒性作用有部分是通过激活RAS而产生的。蛋白负荷可促进单侧肾切除术的大鼠近端肾小管表达肾素、ACE以及血管紧张素原增加 ［2］。在转染血管紧张素原基因的小鼠，出现血压升高、白蛋白尿，同时应用培哚普利(perindopril)的小鼠上述症状明显减轻 ［11］。�
早在20世纪80年代,人们就认识到ACEI不仅能阻断循环RAS、扩张全身血管而降低血压，而且可通过扩张肾小动脉使肾小球毛细血管静水压降低，而血浆流量并未减少，从而减少尿蛋白，延缓CKD的进展［12］。有研究表明，ACEI可抑制肾损伤后引起的TGF-β mRNA表达增加,并降低其转录，这提示ACEI可能通过抑制TGF-β的表达而抑制肾脏纤维化 ［13］。�
最近研究发现，肾脏局部RAS主要有两条效应相反的代谢途径 ［14］。血管紧张素原在肾素作用下酶解为Ang Ⅰ，后者再被ACE降解为Ang Ⅱ。Ang Ⅱ主要通过靶细胞膜上的血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1受体)发挥多种生物学效应，包括收缩血管、促进组织增生、炎症反应、纤维化等。另外，Ang Ⅰ还可被ACE2降解为Ang-(1-9)，后者再被ACE降解为Ang-(1-7)；而ACE2也可直接降解Ang Ⅱ, 形成Ang-(1-7)作用于mas受体，发挥与ACE-Ang Ⅱ-AT1途径相反的作用，表现为舒张血管、抑制增生、抗炎和延缓纤维化［15］。因此，现在越来越多的人认为，ACE/ACE2的激活状态可能直接决定了肾脏局部Ang Ⅱ产生的水平。�
本研究在培养的肾小管上皮细胞，首先观察ACEI对于BSA刺激后HK2细胞ACE、ACE2表达的变化。结果显示，BSA在增加ACE表达的同时抑制ACE2的表达，CAP在基因和蛋白水平均能抑制BSA引起的ACE的表达上调和ACE2表达的缺失，提示CAP不仅抑制循环ACE的酶活性，而且在肾脏局部可抑制白蛋白引起的ACE和ACE2表达的失衡。本研究结果还显示，在细胞上清液中，BSA可引起Ang Ⅱ浓度显著增加，此现象可被CAP明显抑制，提示CAP抑制BSA所诱导的Ang Ⅱ产生可能与其抑制ACE表达而增加ACE2表达有关。本研究结果也进一步证实了ACEI具有双途径控制肾脏局部Ang Ⅱ水平的作用，为理解ACEI的肾保护作用机制提供了进一步的实验依据。Ferrario等[16]报道，服用ACEI的大鼠血浆Ang-�(1-7)水平明显增高。有人也发现在心肌梗死的大鼠，Ang-(1-7)可减少心衰的发生[17]，提示增加ACE2的表达和活性对抑制局部RAS有重要影响。�
总之，本实验发现CAP能上调ACE2 mRNA和蛋白表达，此现象是否与ACE受抑制反馈性引起ACE2的增加有关，尚待进一步研究。ACEI具有对肾小管上皮细胞ACE/ACE2双向表达的调节作用，并能通过抑制RAS激活而发挥对肾脏的保护作用。�
[参考文献]�
[1]Remuzzi G, Perico N, Macia M, et al. The role of reninangiotensin-aldosterone system in the progression of chronic kidney disease[J]. Kidney Int, 2005, 68 (Suppl 99): S57-S65.�
[2]Largo R, Gomez-Garre D, Soto K, et al. Angiotensin-cnverting enzyme is upregulated in the proximal tubules of rats with intense proteinuria[J]. Hypertens, 1999, 33: 732-739.�
[3]Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method[J]. Methods, 2001, 25: 402-408.�
[4]Maschio G, Alberti D, Janin G, et al. Effect of the angiotensin-converting-enzyme inhibitor benazepril on the progression of chronic renal insufficiency. The angiotensin-converting-enzyme inhibition in progressive renal insufficiency study group[J].N Engl J Med, 1996, 334： 939-945.�
[5]GISEN. Randomized placebo-controlled trial effect of ramipril on decline in glomerular filtration rate and risk of terminal renal failure in proteinuric, non-diabetic nephropathy[J]. Lancet, 1997, 349: 1857-1863.�
[6]Praga M, Gutierrez E, Gonzalez E, et al. Treatment of IgA nephropathy with ACE Inhibitors: a randomized and controlled Trial[J]. J Am Soc Nephrol, 2003, 14: 1578-1583.�
[7]van de Wal R M A, Gansevoort R T G, van der Harst P, et al. Predictors of angiotensin-converting enzyme inhibitor-induced reduction of urinary albumin excretion in nondiabetic Patients[J]. Hypertens, 2006, 48: 870-876.�
[8]Abbate M, Zoja C, Remuzzi G. How does proteinuria cause progressive renal damage? [J]. J Am Soc Nephrol, 2006, 17: 2974-2984.�
[9]Wolf G, Butzmann U, Wenzel U O. The rennin-angiotensin system and progression of renal disease: from hemodynamics to cell biology[J]. Nephron Physiol, 2003, 93 (1): P3-13. �
[10]Remuzzi G, Perico N, Macia M, et al. The role of reninangiotensin-aldosterone system in the progression of chronic kidney disease[J]. Kidney Int, 2005, 68 (Suppl 99): S57-S65.�
[11]Sachetelli S, Liu Q, Zhang S L, et al. RAS blockade decreases blood pressure and proteinuria in transgenic mice overexpressing rat angiotensinogen gene in the kidney[J]. Kidney Int, 2006, 69: 1016-1023.�
[12]Ruster C, Wolf G. Renin-angiotensin-aldosterone system and progression of renal disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2006, 17: 2985-2991.�
[13]Gaedeke J, Peters H, Nobel N A, et al. Angiotension Ⅱ, TGF-β and renal fibrosis[J]. Contrib Nephrol, 2001, 135: 153-160.�
[14]Danilczyk U, Eriksson U, Crackower M A, et al. A story of two ACEs[J]. J MolMed, 2003, 81: 227-234.�
[15]Bernstein K E. Two ACEs and a heart[J]. Nature, 2002, 417(6891): 799-802.�
[16]Ferrario C M, Jessup J, Gallagher P E, et al. Effects of rennin-angiotensin system blockade on renal angiotensin-�(1-7) forming enzymes and receptors[J]. Kidney Int, 2005, 68: 2189-2196.�
[17]Loot A E, Roks A J, Henning R H, et al. Angiotensin-(�1-7) attenuates the development of heart failure after myocardial infarction in rats[J]. Circulation, 2002, 105 (10): 1548-1550.�
［收稿日期］2008-06-05
