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【摘要】 目的 研究血红素氧合酶．1（HO．1）/一氧化碳（CO）系统在肺纤维化大鼠中的表达及药物干预影响，为肺纤维化的诊治提供一种新方法。方法 应用健康Wistar大鼠60只,随机分为4组，分别为对照组、肺纤维化组(纤维化组)、肺纤维化加HO．1特异激动剂组(加强组)、肺维化加HO．1特异抑制剂组(抑制组)。检测各个模型组中大鼠肺组织与血清中HO．1/CO体系表达情况，分析HO．1/CO体系在大鼠肺纤维化中的作用，以及药物对肺纤维化程度的影响。结果 在对照组中，HO．1与COHb在大鼠肺组织和血清中低表达，且两者差异无统计学意义(P>0．05)，在单纯组、加强组、抑制组中，与对照组相比，HO．1与COHb在大鼠肺组织和血清中均高表达，以加强组为重，抑制组最低，两者差异具有统计学意义(P0．05).In idiopathic pulmonary fibrosis group，group of specific stimulator and the group of specific inhibitor，HO．1 expression and COHb expression in blood and lung tissues was higher than the goup of control， and there was significant association between HO．1 expression and COHb expression(P[1]提示气道平滑肌中存在HO．1和HO．2,HO．1主要是被一些因素诱导产生,包括缺氧、应激等。Prabhakar[2]等的研究表明，通常HO．1的表达很低甚至缺乏,但在应激和缺氧情况下明显提高，肺纤维化可使机体处于缺氧状态，故推测可使HO．1的表达增加，体内COHb生成增多，利用大鼠肺纤维化模型和应用HO．1的特异性激动剂和抑制剂，研究HO．1/CO在肺纤维化大鼠中的表达及药物干预的影响，为临床肺纤维化治疗提供一种新方法。
1 材料与方法
1．1 材料 应用佳木斯大学动物实验中心提供健康Wistar大鼠(黑动第99102001)60只,雌雄各半,体质量170~200 g,正铁血红素购自美国Sigma公司，锡原卟啉(SnPP)购自美国Sigma公司，博莱霉素(BLM．A5)购自黑龙江省哈尔滨博莱制药有限公司，UV．756MC型紫外可见分光光度计购自上海精密化学有限公司。
1．2 方法
1．2．1 模型制备 参考文献方法略做改进[3．4]，将大鼠麻醉，气管内注射博来霉素(BLM．A 5．5 mg/kg)0．2~0．3 ml，建立肺纤维化组模型，气管内注射等量的生理盐水建立对照组模型，在肺纤维化模型组基础上分别腹腔注射血晶素或锡原卟啉(125 μmol/kg)注射液0．5 ml/d，建立加强组与抑制组模型。
1．2．2 评价 病理学检查:在大鼠肺纤维化造模后第7、14、28 d,在每个实验组随机处死5只动物,分离肺脏,注入10%(体积分数)福尔马林液1．5 ml保持30 min后,投入Bouins液固定24 h,常规脱水,石蜡包埋后,切片(3 μm)，行苏木精．伊红(HE)和Mallorys三色染色。光镜下观察有无炎性反应及纤维化发生。评价是采取Szapiel等[5]定量或半定量方法。
1．2．3 观察指标
1．2．3．1 肺组织与血清中HO．1活性测定 将肺均浆上清液和血清各20 μl中加入2 mmol/L正铁血红素40 μl，4．5 mmol/L还原性辅酶Ⅱ40 μl，同一只健康豚鼠的肝组织匀浆上清液20 μl,0．1 mol/L的KH2PO4缓冲液(pH 7．4)1．8 ml，避光置37℃恒温水浴箱中，10 min后，将反应物棕色小瓶置于冰上终止反应。不含NADPH的样品做空白对照，在分光光度计上用464 nm和530 nm双波长测定胆红素生成量[2]
1．2．3．2 全血COHb含量测定：参照乐宏元等[6]的方法，新鲜血中加入保险粉(Na2S2O4)250 mg，使样品中多组分的血红蛋白转化为Hb和COHb两个组分，在UV．756MC型紫外可见分光光度计上用420 nm和432 nm两个波长测定吸光度，依比尔定律建立综合方程式求出全血COHb的百分含量。
1．3 统计学处理 实验数据以均数加标准差(x±s)表示，计数资料采用SPSS13．0软件进行t检验、相关性分析，计量资料采用秩和检验。
2 结果
2．1 大鼠肺组织形态学及病理学观察 在对照组中，第7、14、28天肺组织成淡红色，表面光滑，未见明显出血点，无明显炎性反应及纤维化的发生，且各时间段无明显变化。在肺纤维化组中，肺组织出现明显的出血水肿，并逐渐融合成片，形成斑片状、结节状纤维化，并随时间延长，肺纤维化组中炎性反应程度逐渐减轻，纤维化程度逐渐加重；加强组中，仅出现炎性反应性改变，无肺纤维化发生；抑制组中，肺纤维化程度较对照组、肺纤维化组及加强组最重，出现广泛的肺纤维化。
2．2 大鼠肺组织肺泡炎及纤维化程度 在正常对照组中仅可见少量轻度肺泡炎；在肺纤维化组中，造模后的第7天，出现广泛的肺泡炎，在第14天、28天组中，随着时间的延长，炎性反应逐渐减轻，肺纤维化程度逐渐加重，形成广泛的肺纤维化；激动剂组中，肺泡出现较轻的炎症改变，无肺纤维化形成；在抑制剂组中，肺纤维化程度最重，出现广泛的肺纤维化。
2．3 大鼠血清COHb水平变化 在激动剂组与纤维化组中，血清COHb水平随时间逐渐增加；在抑制剂组中血清COHb水平逐渐减少，各组比较见表1。
3 讨论
3．1 关于博来霉素致大鼠肺纤维化的动物模型 肺纤维化是一种慢性炎症性间质性肺疾病，主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化病变，从起始症状到病情逐渐恶化，进而导致呼吸功能不全而死亡一般为3~5年，其病因尚不清楚，发病机制仍不明了。为了探讨HO．1/CO体系在大鼠肺纤维化中的表达及血晶素及锡原卟啉对其的干预，复制稳定的动物模型是本试验的根本保证。本试验对博来霉素导致大鼠肺纤维化进行了28 d的动态观察，包括整体病情、精神、饮食、活动能力、一般反应、体质量的变化以及肺组织病理学观察，结果显示本试验采用博来霉素致肺纤维化模型是成功而稳定的，与文献结果一致。
3．2 血红素氧合酶．1/一氧化碳与肺纤维化 血红素氧合酶(heme oxygenase,HO)是哺乳动物体内与亚铁血红素代谢相关的,一族具有多种功能的微粒体氧化酶，是血红素分解代谢的限速酶，由HO．1、HO．2和HO．3三种同工酶构成，其中HO．1为诱导型的血红素氧合酶，它广泛分布于全身组织细胞的微粒体内，其活性在多种因素的诱导下，约可提高100倍，是目前已知最易受诱导的酶之一。一氧化碳(CO)与一氧化氮(NO)一样，都是双原子、小分子气态物质，20世纪90年代初期CO受到广泛关注，研究结果证实，CO是一种重要的细胞信使分子，在细胞功能和通讯的调节中发挥信号转导作用，其在心血管、呼吸、神经、免疫和内分泌等系统中发挥着重要的生物学效应。
通过本实验研究发现，对照组肺组织与血清中HO．1含量与血清中COHb的含量均很少，且两者无明显相关性，在单纯肺纤维化组中其两者的含量明显增加，并成正相关发展(P[7]认为HO系统是产生内源性CO的唯一途径,血红素经HO系统降解生成胆红素和CO,而经其他方式降解的血红素不生成CO。因此，肺纤维化时体内内源性CO水平升高与HO．1活性增加密切相关。通过病理发现，HO．1特异性激动剂可以有效的抑制肺纤维化的形成，而HO．1特异性抑制剂可以加重肺纤维化的形成，根据此发现我们可以通过检测肺组织与血清中HO．1活性和血清中COHb含量作为对肺纤维化诊断途径之一，并应用HO．1激动剂对肺纤维化作出有效的治疗，可以作为对肺纤维化治疗的一种新途径，其机制尚不明确，有待继续研究。
参考文献
1 McCoubrey WK,Huang TJ,Maines MD.Isolation and characterization of a cDNA from the rat brain that encodes hemoprotein heme oxygenase．3．European Journal of Biochemistry,1997,247:725．732.
2 Prabhakar N R，Dinerman JL，Agani FH，et al.Carbon monoxide:a role in carotidbody chemoreception.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(6):1994．1997.
3 Kai Zh,Mehrnaz GK，Bridget MC，et al.TNF．α mediated lung cytokine networking and eosinpphil recrucitment in pulmonary fibuosis.Immunology,1996,23:954．959.
4 李学军，崔社怀.三七总甙及甲泼尼龙对实验大鼠肺纤维化的干预作用及机制的初步探讨.中华结核与呼吸杂志，2002，25：520．523.
5 Szapiel SV，Elson NA，Fulmur JD，et al.Bleomycin．induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse.Am Rev Respir Dis，1979,120:893．899.
6 乐宏元,宋小兴,刘和平.一氧化碳血红蛋白双波长定量测量.临床检验杂志，1996，14(2):87．88.
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