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【摘要】 目的 探讨免疫金银染色法检测抗核抗体(ANA)、抗dsDNA抗体对诊断系统性红斑狼疮(SLE)的价值。方法 采用免疫金银染色法(IGSS)检测SLE患者血清中ANA和抗．dsDNA。结果 活动期ANA、抗．dsDNA阳性率与非活动期比较差异有统计学意义(P[1．3],建立了采用普通光学显微镜检测血清抗核抗体、抗dsDNA抗体(A．dsDNA)的免疫金银染色法(immunogold silverstaining,IGSS)，并对系统性红斑狼疮患者血清进行了检测，取得满意效果,报告如下。
1 材料和方法
1．1 抗原
1．1．1 ANA抗原 欧蒙德国医学实验诊断公司，订货号FA 1 510．1 003．1,靶抗原基质人HEp．2细胞，猴肝切片(每个反应区2张生物薄片)。
1．1．2 双链DNA抗原 欧蒙德国医学实验诊断公司，订货号FA 1 572．1 003,靶抗原基质绿蝇短膜虫。
1．2 待检血清
1．2．1 SLE患者血清 为2002年以来本实验室血清库收集的新乡市各医院送检的SLE患者血清，符合1982年美国风湿病协会诊断标准。其中临床确诊但未经治疗的活动期患者86例,治疗后非活动期患者35例。肾损害标准: ①蛋白定量>0．5 g/d或蛋白尿“+++”以上,②有细胞管型。
1．2．2 正常对照血清 为新乡市中心血站无偿献血员血清,共46份。
1．3 金标记羊抗人IgG
1．3．1 亲合层析提纯羊抗人IgG为华美生物工程公司产品。
1．3．2 胶体金溶液 由本实验室参考全国临床检验操作规程[3]通过鞣酸．枸橼酸钠还原法制备直径为5 nm的胶体金溶液。
A液：1%HAuCl4水溶液1 ml加入79 ml双蒸馏水中混匀。
B液：1%枸橼酸三钠4 ml，1%鞣酸0．7 ml，0．1 mol/L K2CO3液0．2 ml，混合，加入双馏水至20 ml。
将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5 nm。
1．3．3 待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白羊抗人IgG预先于0．005 mol/L pH7．0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000 g4℃离心1 h，去除聚合物。
1．3．4 待标胶体金溶液的准备 以0．1 mol/L K2CO3或0．1 mol/L HCl调胶体溶液的pH值至9．0；由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。
1．3．5 胶体金与标记蛋白用量之比的确定 ①将胶体金溶液调好pH之后，分装10管，每管1 ml;②将标记蛋白羊抗人IgG以0．005 mol/L pH9．0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5~50 μg/ml，分别取1 ml，加入上列金胶体金溶液中，混匀。对照管只加1 ml稀释液;③5 min后，在上述各管中加入0．1 ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2 h，观察结果;④结果观察，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1 ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10%~20%。
1．3．6 胶体金与羊抗人IgG的结合 将胶体金和羊抗人IgG溶液分别以0．1 mol/L K2CO3调pH至9．0，电磁搅拌羊抗人IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10 min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。我们加入5%BSA作为稳定剂使溶液终浓度为1%。
1．3．7 胶体金标记蛋白的纯化 采用超速离心法：先低速离心1 800 r/min，20 min，弃去凝聚的沉淀。然后将5 nm胶体金结合物用6 000 g，4℃离心1 h；仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PBS液(含0．02%NaN�3)，将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。在结合物内加50%三酰甘油可贮存于．70℃保存1年以上。
1．3．8 胶体金蛋白结合物的质量鉴定 胶体金颗粒在波长510~550 nm之间出现最大吸收值峰。用0．02 mol/L pH8．2 PBS液(含1%BSA，0．02%NaN�3)将胶体金蛋白试剂作1�∶�20稀释，OD��520�＝0．26,符合要求。(一般应用液的OD��520�应为0．2~0．4)。
1．4 银染液配制 采用本实验室[4]配方液,A液:0．22%乙酸银溶液。B液:50%阿拉伯树胶,去离子水溶解,每天摇动,5 d后取滤液使用;C液:1%对苯二酚溶液,500 mg对苯二酚溶于30 ml 0．05 mol/L pH3．8柠檬酸盐缓冲液中。D液:在C液中加入10~40 ml B液。银染液:将A液和D液等量混合即成(临用前配)。
1．5 稀释液及洗液 pH7．2,0．01 mol/L PBS．Tween20缓冲液。
1．6 检测流程 稀释 用稀释液稀释血清。
加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25 μl稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。
第一次温育：将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。室温温育30 min。
清洗：用烧杯盛PBS．Tween洗涤液，流水冲洗载片1 s然后立即(不要吹干)将其浸入装有PBS洗涤液的小杯中浸洗至少1 min。
加样：滴加25 μl 1�∶�20稀释的金标记羊抗人IgG至洁净加样板的反应区中。
第二次温育：从PBS洗涤液中取出载片(抗原片)，5 s内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。室温温育30 min。
清洗：用烧杯盛PBS洗涤液流水冲洗载片1 s，然后立即将其浸入装有PBS洗涤液的小杯中浸洗至少1 min。再将其浸入去离子水的小杯中浸洗至少2次/min,浸入双蒸水的小杯中浸洗至少1次/min。
银染：滴加25 μl 混合后的银染液至洁净加样板的反应区中加混合后的银染液，从双蒸水的小杯中取出载片(抗原片)，5 s内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片(抗原片)是否与液滴接触良好，然后继续下一张。室温温育10 min。
清洗：用烧杯盛去离子水流水冲洗载片1 s(注意水流不要太急，不要直接对着基质冲)，然后立即将其浸入去离子水的小杯中浸洗至少3次/min。
镜检：晾干后光学显微镜10×40下观察细胞核着色情况。ANA阳性反应为细胞核内结构被染成黑色，阴性为核区不着色,在浅灰色的背景下呈白色空泡状;双链DNA抗体阳性反应为绿蝇短膜虫动基体结构被染成黑色。ANA、抗．dsDNA抗体血清滴度≥1∶20为阳性。进行IGSS时，均设有阳性对照、阴性对照和空白对照。
1．7 统计学分析 SPSS13．0统计软件对数据作χ2检验。
2 结果
2．1 ANA、A．dsDNA检测结果 见表1。活动期SLE患者血清中ANA、抗dsDNA阳性率均高于非活动期ANA、抗dsDNA阳性率。二者经χ2检验,χ2��ANA�=19．778,χ2��A．dsDNA�=43．523,P ��ANA�[3]建立了一种新的标记物系统．免疫胶体金技术用于免疫细胞化学，现在已应用于光镜和电子显微镜标本抗原和抗体的检测。胶体金的制备方法比较简便，标记抗体也较容易。1983年Holgate[1]等人将免疫金法与银显影方法相结合创立了免疫金银法(IGSS)，即经银显影液增强，使金颗粒周围吸附大量银颗粒，光镜下就可看到阳性反应部位呈金属银的黑褐色，从而提高了灵敏性。IGSS染色方法成功的关键在于要保持好的抗原性，组织结构，并要求有高特异性和高效价的抗体，严格避免金颗粒和银颗粒的非特异性沉积。本文应用欧蒙德国医学实验诊断公司制备的ANA抗原和双链DNA抗原，制备抗人IgG胶体金，达到试验要求。在试验时，应注意以下几点:①掌握抗体、金标抗体的浓度。优选最佳稀释度，可避免非特异染色以及节省抗体；②所用试剂必须以双蒸馏水或去离子水配制，所用玻璃器皿必须洗净，即用中性去污剂、清洗液清洗，充分流水冲洗之后用双蒸水或去离子水洗涤，干后使用;③银显影液必须新鲜配制，本试验使用了乙酸银，故无需避光反应；④控制反应时间，避免形成过多的还原银，非特异地吸附在抗原上。
本文制备的抗人IgG胶体金十分稳定，至少能稳定1年以上。应用IGSS进行ANA和抗ds．DNA抗体血清水平的检测，显示出较高的敏感性。阳性血清稀释数百倍，仍能检测出ANA和抗ds．DNA抗体。应用间接免疫荧光法，阳性血清4℃保存1周、抗ds．DNA抗体就难于测出。应用IGSS，阳性血清4℃~6℃保存1周以上仍然能测出较高效价的抗ds．DNA抗体。该法具有简便、快速等特点，不需要特殊设备，适合于一般实验室及基层医院推广使用。
参考文献
1 Holgate CS.Immunogold silver staining:new method of immuno．staining with enhanced sensitivity.J Histochem cytochem，1983,31:938．944.
2 Beeley JE.Immunocytochemistry:A practical approach，1st ed.Oxford:Oxford University Press Inc，1993:115.
3 叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程(第三版).东南大学出版社,2006:562．564.
4 张铁汉，刘琳，贺志安,等.银强化滴金免疫法检测肾综合征出血热IgM的研究.中华实验和临床病毒学杂志， 2000,14(3)：266.
5 Faulk WP,et al.An immunocolloid method for the electron microscope.Immunochemistry,1971，8：1081.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
