【www.zhangdahai.com--叙职履职报告】
摘 要：目的：多指标考察三七皂苷的大孔树脂法提取工艺。方法：采用高效液相梯度洗脱法作为含量测定方法，以三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1三个指标考察了三七皂苷的大孔树脂纯化工艺。结果：高效液相梯度洗脱法用于三七纯化工艺中各皂苷的含量测定，各皂苷得到良好分离，结果准确、可靠。三七中各皂苷，随脂溶性的增大，大孔树脂纯化的收率呈下降趋势。结论：用高效液相梯度洗脱法测定三七中三种皂苷能更加有效的评估大孔树脂纯化工艺，有利于工艺优化。
关键词：D101大孔树脂；三七高效液相；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1
中图分类号：R284．2 文献标识码：A
文章编号：1007―2349(2007)02―0040－02
五加科植物三七Panax notoginseng(Bruk．)F．H．Chen，具有散瘀止血，消肿定痛的功效，其中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1是其主要的药效成分。采用大孔树脂提取纯化三七皂苷，是较为成熟的工艺，但一般只用紫外分光光度法测定总皂苷做为评价指标[1～2]。Rb1的含量考察了三七皂苷的大孔树脂纯化工艺，方法更加专属、准确。
1仪器与试药
高效液相色谱仪包括二元高压泵、2487检测器、WatersXterra RP18 5μm(4．6×150mm)柱、Breeze工作站(美国Waters)；三七为市售；三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量测定对照品(中国药品生物制品检定所)；D101型大孔树脂(天津农药股份有限公司树脂分公司)；自制重蒸馏水；色谱纯乙腈(德国Merck)；其它试剂均为分析纯。
2方法与结果
2．1树脂型号选择 选用普遍用于皂苷分离的D101型大孔树脂。
2．2树指预处理 用工业乙醇浸泡数天，装柱后用工业乙醇洗至流出液与水1：2混合不产生混浊，改用大量水洗，水浸泡备用。
2．3色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；乙腈：0．05％磷酸溶液梯度洗脱。0～20min，比例从15：85线性增加到30：70；20～25min，比例从30：70线性增加到45：55；25～30min，比例从45：55线性递减到15：85。检测波长为203mm，流速1．0ml／min[3～4]。
2．4对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的三七皂苷R1．00mg、人参皂苷Rg1 2．5mg，人参皂甙Rb1 2．00mg置5ml量瓶中，加乙腈一水(19：81)至刻度，摇匀，即得(每1ml含三七皂苷R1 0．20mg，Rg10．50mf，Rb1 0．40mg)。
2．5供试品溶液的制备 取药材粉末或者样品适量，置5ml容量瓶中，加乙腈一水(19：81)4ml，超声处理45min，放冷，定容。
2．6线性关系及线性范围 取对照品溶液，分别以2、4、12、16μL进样，测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，计算线性回归方程，结果见表1。
2．7精密度试验 取供试品溶液重复测定6次，以3种皂苷的峰面积分别计算，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的RSD分别为1．22％、1．95％、1．28％。
2．8重现性试验 制备6份供试品溶液，按照本文方法测定含量，结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的RSD分别为2．45％、3．21％、2．53％。
2．9加样回收率试验 取同一批次已经测定含量的三七药材粉末，取样量减半，加入等量的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品，按供试品溶液制备方法制备，测定，计算回收率，结果三七皂苷R1的平均回收率为99．4％，RSD为3．1％(n＝6)；人参皂苷Rgl的平均回收率为101．2％，RSD为2．7％(n＝6)；人参皂苷Rb1的平均回收率为96．3％，RSD为3．6％(n＝6)。结果见图1。
2．10制备三七提取液 取已测含量的三七药材10g，用70％乙醇加热回流提取数次，合并提取液，回收乙醇至一定量，加入适量水，继续回收至无醇味，加水使提取液总体积为20ml，10摄氏度下保存备用。
2．11吸附容量测定 吸取20ml提取液，通过预处理好的大孔吸附树脂层析柱(11．3mm内径，15g，相当于干树脂5g，柱高为20cm)，用蒸馏水洗脱至无色，测定水吸脱液中各皂苷含量；用95％乙醇100ml再生树脂，测定95％乙醇洗脱液中各皂苷的量(mg)。结果见表2。
因为95％醇洗部分皂苷含量(吸附的量)约为水洗部分(没有被吸附部分)的2倍，大约相当于上样总量的2／3，即约14ml上样液，所以确定上样量为10ml。
2．12洗脱剂、洗脱速度[1,2,5,～7,]用水洗脱杂质，50％乙醇洗脱总皂苷。为保证皂苷与树脂的吸附和解吸充分平衡，流速为1.0ml／min。
2．13树脂分离 根据树脂的吸附量，吸取10ml药液通过预处理的大孔吸附树脂柱，水洗至洗脱液无色，然后用50％乙醇洗脱，洗脱至不显人参皂苷的化学反应；再用95％乙醇洗脱，洗脱至流出液无色，测定各皂苷含量。结果见表3。
50％乙醇洗脱液部分，水浴上蒸干，得三七总皂苷0．213g，经测定含有三七皂甙R18．47mg，人参皂苷Rgl37．5mg，人参皂甙Rbl 20．77mg。
3讨论
用高效液相法梯度洗脱同时测定多个皂苷的含量，与紫外法测定总皂苷相比，可以排除非皂苷成分造成的干扰．提高监测方法的准确性。本实验证明，高效液相法梯度洗脱同时测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1是准确、有效的方法。
D101大孔吸附树脂具有吸附快、解吸率高、吸附量大、再生简便等优点，非常适合三七总皂苷的纯化。三七总皂苷的纯化多用50％乙醇洗脱，通过本文实验可以看出，随着皂苷极性的减小，不被50％乙醇洗脱的量增加，即同收率降低。如果通过增加50％乙醇体积或者提高洗脱液的含醇量，虽然可以提高收率，但是会影响纯化效果。通过多指标考察，可以更加深入、准确地评价大孔树脂对三七中皂苷的纯化效果，有利于优化工艺条件。
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