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(1.青岛大学医学院；2.山东省泰安市中心医院 山东泰安 271000) ��［摘 要］ 目的检测结肠癌患者外周血中CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达，分析CCR7的表达与结肠癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期的相关性。方法利用流式细胞仪检测44例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测CCR7的阳性表达率。比较结肠癌患者与正常人外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7的表达情况；比较患者术前、术后外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7表达阳性率变化；比较CD3+CD8+T细胞亚群上CCR7表达在术前、术后的变化。结果结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比正常人低，差异有统计学意义（P＜0.05）；术后组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比术前组高，差异有统计学意义（P＜0.05）。外周血CCR7的表达与结肠癌肿瘤的大小、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移等具有显著相关（P＜0.05）。结论CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上高度表达，并与结肠癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期的密切相关。CCR7的表达可能与促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白质有关。
［关键词］结肠癌；趋化因子；CCR7；外周血；T细胞；流式细胞术�
［中图分类号］ R735.3+5［文献标识码］ A［文章编号］ 1672-4208(2008)21-0034-02
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趋化因子(chemokine)是由组织细胞或炎性细胞衍生的、具有白细胞趋化活性的肽分子，其能选择性地引导白细胞亚群的定向游走和组织内集聚。根据趋化因子的氨基酸序列，将趋化因子分为四个亚家族，即CXC、CC、C和CX3C亚家族�[1]。CXC亚家族有IL-8、IP-10，CC亚家族有MCP 1~5等。已有研究表明，趋化因子与许多疾病如肺部的支气管扩张、特发性肺动脉纤维化、风湿病、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等均有密切关系�[2]。由于肿瘤组织存在浸润的免疫细胞，趋化因子与肿瘤的关系受到关注。但是由于结肠癌临床的异质性表现，迄今为止尚缺乏有效理想的肿瘤标志物，因此寻找敏感性、特应性高的结肠癌标志物，以提高结肠癌的早期诊断、疗效评价和预测预后尤为重要。本研究就是利用流式细胞仪技术检测趋化因子受体(chemokine receptor)CCR7在结肠癌患者术前、术后外周血记忆型T细胞亚群上的表达情况，并与正常人相对照，通过与肿瘤免疫逃逸有关的表面抗原以及细胞因子等的检测，为结肠癌临床标志物的筛选、结肠癌发病机制的探讨以及结肠癌的综合防治提供有价值的线索。�
1 材料与方法�
1.1 试剂和仪器 FACScaliur流式细胞仪：美国BD公司。KDC-160HR低温高速离心机：科大创新中佳分公司。可调式微量移液器：德国Eppendrof公司。CELLQuest获取和分析软件：美国BD公司。鼠抗人CD8-FITC、CD3-PE-cy5、CCR7-PE单克隆抗体、溶血素、Falcon管均购自美国BD公司。0.5 M EDTA、PBS缓冲液、Tip头及其他常规试剂与耗材均为国产。1.2 标本来源及分组 44例结肠癌患者为泰安市中心医院2007年4月～2007年10月住院病人，其中男性34例，女性10例，年龄45~74岁，平均年龄57岁。常规根治手术后按照UICC 1997年结肠癌PTMN分期法进行分期。正常对照组44例选自我院健康查体者，经结肠镜取材并经病理证实无胃部疾病。其中男性32例，女性12例，年龄34~84岁，平均年龄59岁。�
1.3 标本的留取及制备 术前2d清晨空腹抽取肘静脉血2 ml置EDTA抗凝无菌试管中送中心实验室做流式检测CCR7表达情况。术后7d再次抽血检测，并查看病人病理情况。将病人按编号在“临床病例登记信息表”中记录其姓名、性别、年龄、住院号、籍贯、家族史、饮食习惯、临床诊断、病理号、病理描述、临床分期、CEA、CA19-9、CA242。�
1.4 研究方法及操作步骤 （1）加入标本血。收集结肠癌患者术前、术后以及正常人外周血，分离PBMC后，在Falcon管中各加入5 μl CCR7-PE、5 μlCD3-PE-Cy5和10 μlCD8-FITC标记的抗体，每管加入50 μl细胞悬液（5×10�5），充分混匀后，室温避光孵育15 min。同时设同型阴性对照管，只加入50 μl细胞悬液。（2）加入溶血素，室温避光8 min。（3）1000 r/min离心5 min，弃上清，再加入0.9%生理盐水4 ml混匀。（4）重复步骤（3）。（5）1000 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μl生理盐水，上机检测。（6）流式细胞仪检测结果，以CELLQuest软件获取细胞，设立同型阴性对照，调整电压，设立淋巴细胞门，检测淋巴细胞数量和CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率。�
1.5 检测及数据采集 利用流式细胞仪检测每一例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测趋化因子受体CCR7的阳性表达率。�
1.6 实验结果的统计学分析 采用ANOVA方差分析，以SAS 9.0统计软件对实验结果进行统计学分析。比较结肠癌患者与正常人外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达情况；比较结肠癌患者术前、术后外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7表达阳性率变化；比较CD3+CD8+T细胞亚群上CCR7在术前、术后的变化。分析结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体CCR7的表达情况与结肠癌肿瘤的大小、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移的相关性。�
2 结果与分析�
我们在检测趋化因子受体CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上的表达情况时，发现获取的大部分CD3+CD8+T细胞可以根据CD8+分子表达强度分为两个亚群：低密度群和高密度群。首先从整体上分析CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上的表达情况，然后对每个亚群单独分析，比较术前、术后亚群的变化。�
2.1 患者组与正常对照组整群检测结果 整群三组间采用ANOVA分析，F＝10.13，P＜0.0001；术前组与术后组比较，P＜0.05，有统计学意义，可以认为结肠癌患者术后组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比术前组高；正常对照组与结肠癌患者组比较，P＜0.05，有统计学意义，可以认为正常对照组外周血CD3+CD8+T细胞上CCR7阳性表达率比患者组高。见表1。�
表1 结肠癌患者组与正常对照组CCR7阳性表达率�
注：(1)与(2)比较、(1)与(3)比较、(2)与(3)比较，P＜0.05。
2.2 患者组两个亚群间检测结果 （1）结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞亚群低密度组采用ANOVA分析，F＝8.15，P＜0.001；术后组与术前组比较，P＜0.05，有统计学意义，可以认为术后低密度群上CCR7阳性表达率增高。（2）结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞亚群高密度组采用ANOVA分析，F＝7.76，P＜0.001；术后组与术前组比较，P＜0.05，有统计学意义，可以认为术后高密度群上CCR7阳性表达率增高。�
2.3 CCR7的表达与结肠癌的相关性分析 分析44例结肠癌患者组织标本病理结果，发现外周血CCR7的表达与结肠癌肿瘤的大小、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移等具有显著相关（P＜0.05），见表2。�
表2 CCR7表达与结肠癌患者临床资料的关系�
3 讨论�
趋化因子是一类由不同类型细胞分泌的低分子量（8～12 kd)的细胞因子，其生物学功能主要是使细胞发生趋化运动，在淋巴细胞的定向迁移、造血细胞和免疫细胞的发育和分化、炎症的发生、血管的生成及肿瘤的发生中分别起着不同的作用�[3]。趋化因子功能的发挥需要由趋化因子受体来介导。趋化因子受体是一类表达于不同类型细胞上的G蛋白耦联受体，含有7个跨膜区，通常表达于免疫细胞、内皮细胞的细胞膜上。趋化因子与其受体的相互作用控制着各种免疫细胞在循环系统和组织器官间定向迁移�[4]。趋化因子受体和其配体结合后，不仅可以参与细胞的生长、发育、分化、凋亡和分布等多种生理功能，而且在多种如炎症反应、损伤的修复、肿瘤的生长和恶化等病理过程中发挥重要作用�[5]。CCR7是一类新发现的趋化因子受体，目前发现CCR7与其配体CCL19和CCL21结合后，在肿瘤生长和转移中起着令人瞩目的作用。我们就从CD3+CD8+T细胞着手，研究CCR7在CD3+CD8+T细胞上的表达及其与抗肿瘤效应、细胞调亡在恶性肿瘤转移方面的作用。�
本实验利用流式细胞仪检测44例患者外周血，以CELLQuest软件分析获取CD3+CD8+T细胞，检测趋化因子受体CCR7的阳性表达率，并与正常人对照比较，分析CCR7的表达与结肠癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期的相关性，探讨CCR7在结肠癌的发生、发展及浸润转移过程中的作用。对实验结果进行综合分析，初步得出以下结论：（1）CCR7在结肠癌患者外周血CD3+CD8+T细胞上高度表达，并与结肠癌的病理分化程度、肿瘤大小和临床分期密切相关。表现为CCR7的含量表达随着结肠癌细胞的分化程度的上升而下降，随着结肠癌临床分期的进展而上升。（2）CCR7的表达可能与促细胞凋亡和抗细胞凋亡蛋白质有关，CCR7影响包括淋巴细胞在内的各种细胞的生存，因此抗细胞凋亡信号的传送是一个重要机制。�
参 考 文 献�
[1] Crazzolara R, Bernhard D. CXCR4 chemokine receptors, histone deacetylase inhibitors and acute lymphoblastic leukemia[J]. Leuk Lymphoma, 2005, 46(11):1545-1551.�
[2] Nagira M, Imai T, Hieshima K, et al. Molecular cloning of a novel human CC chemokine secondary lymphoid-tissue chemokine that is a potent chemoattractant for lymphocytes and mapped to chromosome 9p13[J]. J Biol Chem, 1997, 272(31):19518-19524.
�[3] Stein JV, Soriano SF, Mrini C, et al. CCR7-mediated physiological lymphocyte homing involves activation of a tyrosine kinase pathway[J]. Blood, 2003, 101(1):38.�
[4] Alain PV, Smina AY, Karine C, et al. Antitumor effects of themouse chemokine 6Ckine/SLC through angiostatic and immunological mechanism[J]. Immunol, 2000,165(4):1992-2000.
�[5] Sharma, Stolina M, Luo J, et al. Secondary lymphoid tissue chemokine mediates T cell-dependent antitumor responses in vivo[J]. J Immunol, 2000, 164(9):4558-4563.�
（收稿日期：2008-09-24）
