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[摘要] 目的 研究MMP-2和Fibulin-5在女性盆底功能障碍性疾病（PFD）患者中的表达及其意义。 方法 用免疫组化SP法检测各30例正常对照及PFD患者阴道前壁组织中MMP-2和Fibulin-5的表达。结果 MMP-2在正常组中表达明显低于PFD组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；Fibulin-5在正常组中表达明显高于PFD组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；分娩次数对MMP-2和Fibulin-5表达影响差异无统计学意义（P＞0.05）；绝经前后MMP-2与Fibulin-5表达差异无统计学意义（P＞0.05）；MMP-2和Fibulin-5呈负相关（r=-0.495，P＜0.01）。结论 MMP-2和Fibulin-5在PFD发生发展中起着重要的作用。MMP-2及Fibulin-5对PFD疾病的发生发展影响的途径不同，MMP-2和Fibulin表达互为拮抗。
[关键词] 女性盆底功能障碍性疾病；MMP-2；Fibulin-5
[中图分类号] R711.2[文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）25-42-02
Expression and Significance of MMP-2 and Fibulin-5 in Pelvic Floor Dysfunction
DONG Ke
The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325400，China
[Abstract] Objective To investigate the expression and function of MMP-2 and Fibulin-5 in the patients with PFD. Methods Biopsies of vaginal wall tissue were obtained at the time of surgery from 60 women. The tissue of 30 with PFD was compared with that of 30 women with other benign conditions. The expression of MMP-2 and Fibulin-5 were detected by immunohistochemistry in vaginal wall tissue. Results The expression of MMP-2 was significantly higher in patients with PFD （P＜0.01）；but the expression of Fibulin-5 was lower（P＜0.01）；and delivery times and menopausal status have nothing to do with the expression of MMP-2 and Fibulin-5（P＞0.05）；there was a negative correlation between MMP-2 expression and Fibulin-5 expression （r=-0.495，P＜0.01）. Conclusion MMP-2 and Fibulin-5 may play an important role in the onset and development of PFD；and the method of it may different from traditional injuries. MMP-2 and fibulin-5 would antagonized each other.
[Key words] Female pelvic floor dysfunction disease；MMP-2；Fibulin-5
女性盆底功能障碍性疾病（pelvic floor dysfunction，PFD）可表现为子宫脱垂等盆腔器官脱垂（pelvic organ prolapse，POP）及压力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）等疾病。PFD好发于中老年妇女，是一种常见但尚未被充分认识的疾病。随着人口老龄化和对生活质量要求的提高，其发病率有增高的趋势，严重影响中老年妇女生活质量，因此究其原因、治其根本对于降低医疗支出、提高中老年妇女生活质量尤为重要[1]。目前研究认为PFD的发生与盆底支持组织结构功能完整性被破坏密切相关。本文对盆底支持组织结构中两个重要因子MMP-2及Fibulin-5进行研究，探讨其在PFD疾病发生过程中的作用。
1资料与方法
1.1一般资料
选取温州医学附属第二医院2009年5月～2011年5月就诊的PFD患者30例（PFD组）。PFD组患者行阴式子宫切除术和阴道前后壁修补术。取同期因子宫良性病变行阴式子宫切除术者30例。两组患者一般情况比较差异无统计学意义，表见1。
表1入选患者一般资料比较
组别n 年龄
（χ±s，岁） 阴式分娩次数（χ±s，次） 体重指数（χ±s，kg/m2） 绝经状态
PFD组30 58.7±3.92.6±0.9 23.0±3.327/30
对照组 30 57.9±4.12.4±1.0 24.6±3.926/30
t/u 0.721.13 1.590.397
P ＞0.05＞0.05 ＞0.05＞0.05
1.2免疫组化试剂及染色方法
所有阴道前壁标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋。一抗分别为MMP-2鼠抗人单克隆抗体（美国chemicom公司）及Fibulin-5鼠抗人单克隆抗体（美国ebioscience公司）。选用即用型SP-9000 HistostainPlus免疫组化检测试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。采用SP法进行免疫组化染色，操作过程如下：切片脱蜡入水，用微波修复组织抗原，高火7min，暂停3min，后用中高火3min，PBS洗片5min×2次；用3%H2O2孵育10min减低过氧化物酶活性；后用PBS洗片3min×3次；室温孵育山羊血清10min封闭非特异性背景；一抗（1�100稀释），4℃孵育过夜后PBS洗片5min×3次；酶标二抗孵育室温下3min，PBS洗片3min×3次；DAB孵育1min显色，并在显微镜下明确后，水洗终止；复染、水洗反蓝、封固，最后光镜观察。选PBS作阴性对照。采用IPP5.0图像分析软件计算阳性部位的吸光度值（A值）。
1.3统计学处理
数据资料以（χ±s）表示，检验数据采用SPSS10.0软件进行处理，P＜0.05为差异有统计学意义。两组间均数比较采用t检验，指标间相关性采用Spearman相关分析。
2结果
2.1MMP-2和Fibulin-5的表达
MMP-2蛋白表达主要分布于细胞浆，略见于胞核。在正常组中表达明显低于PFD组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。Fibulin-5主要分布于细胞外基质，在正常组中表达明显高于PFD组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。见表2。
表2MMP-2与Fibulin-5在盆底组织中表达的A值比较（χ±s）
组别 n MMP-2 Fibulin-5
PFD组 30 99.67±0.8398.51±2.11
对照组30 84.23±0.24108.14±2.43
t 97.9116.49
P ＜0.01 ＜0.01
2.2 经阴道分娩次数和绝经状态对MMP-2及Fibulin-5表达的影响
在所有病例中经阴道分娩＜2次患者20例，≥2次患者40例，分娩次数对MMP-2和Fibulin-5 A值表达影响差异无统计学意义（P＞0.05）。已经绝经患者53例，未绝经患者7例，绝经前组与绝经后组MMP-2与Fibulin-5的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。
表3经阴道分娩次数和绝经状态对MMP-2及Fibulin-5的A值表达的影响（χ±s）
项目n MMP-2 Fibulin-5
A值表达 t值 P值 A值表达 t值 P值
分娩次数＜2次 20 92.10±3.31.50 ＞0.05 102.76±3.1 1.31 ＞0.05
≥2次 40 93.15±2.1 10180±2.4
绝经状态 已绝经53 95.32±1.11.08 ＞0.05 99.65±2.3 1.14＞0.05
未绝经 7 94.72±2.8 100.76±3.4
2.3 MMP-2和Fibulin-5表达的联合分析
用Spearman相关分析对MMP-2和Fibulin-5表达的A值进行分析，该结果表明MMP-2和Fibulin-5表达负相关（r=-0.495，P＜0.01），即随着一种蛋白表达的增强，另一种蛋白表达被抑制。
由上述研究结果可见，MMP-2和Fibulin-5在PFD发生发展中起着重要的作用。MMP-2及Fibulin-5对PFD疾病的发生发展影响的途径不同于传统分娩损伤。MMP-2和Fibulin互为拮抗。
3讨论
胶原和弹性纤维作为盆底支持组织细胞外基质的重要成分，其功能受影响将导致支持组织失去弹性、盆底松弛、PFD发生[2]。2002年Lang等[3]发现POP和SUI患者胶原代谢状态活跃，推导出胶原分解的增加可能是导致SUI和POP原因之一。弹性纤维是细胞外基质富含弹性的重要成分。弹性纤维的缺乏会导致一些重要的疾病，如肺气肿、主动脉瘤等[4]。Szekeres等研究表明，小鼠PFD的发生与其维持自生弹性纤维的稳态失调有关。
MMPs主要是由结缔组织细胞、中性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、单核巨噬细胞、肿瘤细胞等合成和分泌的一组锌离子依赖性内切蛋白水解酶，其结构及功能高度保守[5]。MMPs能降解细胞外基质膜的有效成分，调节细胞的黏附，并作用于细胞外组分及其他蛋白成分，启动潜在的生物功能，参与了组织模型再塑及创伤修复等生理过程。基质金属蛋白酶是惟一一种可降解纤维素类胶原的降解酶类，其表达的变化可能是PFD患者盆底胶原代谢变化的一个重要机制[6]。在本实验中也得到论证，PFD组中的MMP-2的表达较对照组明显升高，可推导出在PFD患者的胶原降解较非PFD组活跃。
Fibulin-5是细胞外基质蛋白Fibulin家族中的最新发现的成员。Fibulin-5与LOXL-1协同以原纤维的形式广泛分布于富含弹性蛋白的组织，能与弹性蛋白直接结合，并将其特定的序列锚定于细胞表面，这对细胞弹性纤维的形成十分关键[7]。2007年Hirai等[8]学者在进行人皮肤成纤维细胞培养技术研究中发现，Fibulin-5能聚集原弹性蛋白，诱导生成弹性纤维。2007年Drewes等[9]研究发现，有92%（33/36）、6个月龄敲除Fibulin-5基因小鼠表现为POP。在本实验中，正常组中Fibulin-5表达明显高于PFD组，提示了在PFD组，弹性纤维生成减少。
因此，我们可以得出这样的结论，PFD通过增加MMP-2的表达和减少Fibulin-5的表达导致胶原降解增加与弹性纤维生成减少，从而出现PFD的一系列临床症状。然而，在本实验中，分娩次数的多寡及患者是否绝经对于MMP-2及Fibulin-5的表达却无影响，这就与传统认为分娩损伤及激素状态变化导致PFD发生的推论有悖。同时，本实验得出在胶原通路上发挥作用的MMP-2与在弹性纤维通路上发挥作用的Fibulin-5的表达互为拮抗，这表明该二者有可能受到同一个机制的调控。当该调控机制失衡时，PFD疾病发生。因此在接下来的实验中，我们拟以此为切入点对年轻未生育的女性患者进行研究，这或许能找到PFD发生及发展的真正触发点。
[参考文献]
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[7] Schiemann WP，Albig AR. Fibulin-5 function during tumorigenesis[J］. Future Oncol，2005，1（1）：23-35.
[8] Hirai M，Ohbayashi T，Horiguchi M，et al. Fibulin-5/DANCE has an elastogenic organizer activity that is abrogated by proteolytic cleavage in vivo[J]. J Cell Biol，2007，176（7）：1061-1071.
[9] Drewes PG，Yanagisawa H，Starcher B，et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice：pregnancy -induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina[J]. Am J Pathol，2007，170（2）：578-589.
（收稿日期：2011-06-29）
