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[摘要] 目的 探讨BMSCs移植治疗肝硬化的最佳移植途径。方法 1.取6周龄健康SD雌性大鼠股骨骨髓,以密度梯度离心和贴壁法分离纯化BMSCs。2.体重250~300g雌性SD大鼠60只,CCl4联合酒精制做肝硬化模型。3.取模型大鼠50只随机分为对照组,尾静脉移植组,肝脏移植组,脾脏移植组,门静脉移植组,每组10只。各实验组均移植DAPI标记的BMSCs。4.3周后比较各组大鼠肝功能。结果 实验各组大鼠肝功能均明显改善,其中肝脏局部移植组效果优于其他各组,其他各组之间差异无统计学意义。结论 通过肝脏局部移植BMSCs治疗肝硬化比经外周静脉、门静脉、脾脏更有优势。
[关键词] 骨髓间充质干细胞;肝硬化;细胞移植
[中图分类号] R5 [文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2010)02-07-03
Therapeutic Effect of Different Channels of BMSCs Transplantation on Liver Cirrhosis in Rat
WANG Mancang1SHANG Zhonghua2ZHANG Xiaoliang1JIA Chenle1
1.Department of Surgery,the Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China; 2.The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effect of BMSCs on liver cirrhosis induced by CCl4 and to explore the best way to transplantation. Methods 1.The femur bone marrow was taken from healthy 6-week-old SD female rats,and the separation and purification of BMSCs were carried out by using density gradient centrifugation and adherence method. 2.Sixty healthy female SD rats weighted 250~300g were prepared for cirrhosis models induced by CCl4 and alcohol. 3.The model rats were randomly divided into 5 groups: control group,tail vein transplant group,partial liver transplant group,spleen transplant group and portal vein transplant group,with 10 rats in each group. All experimental groups received DAPI labeled BMSCs transplant. 4. Three weeks after the transplantation,the liver function in rats was compared. Results The liver function of all the experimental groups was significantly improved compared with the control group,the partial liver transplant group being better than the other groups,with no significant difference between the other groups. Conclusion Partial liver BMSCs transplantation is better in liver cirrhosis than other transplantation channels.
[Key words] BMSCs;Liver fibrosis;Cell transplantationion
1999年,Petersen等[1]首次报道大鼠BMSCs分化为肝细胞和胆管上皮细胞的潜能。由于BMSCs生长能力旺盛,易于大量培养,不表达MHCII类分子,不表达或低表达MHCI类分子,异基因移植甚至异种移植时也不会发生明显的免疫排斥反应,因而最有希望成为未来肝脏疾病细胞治疗的种子细胞。目前BMSCs移植的途径很多,不同移植途径的疗效对比尚无定论。鉴于此,本实验对肝脏局部移植,脾脏局部移植,门静脉移植,尾静脉移植四种途径之间加以对比,为BMSCs移植治疗肝脏损伤性疾病提供理论依据和实验基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物健康SD雌性大鼠60只,体重为250～300g,制做肝硬化模型用;4周龄SD雌性大鼠1只,提取BMSCs用,山西医科大学实验动物中心提供。
1.1.2主要试剂胎牛血清(杭州四季清),percoll液(天津撷洋公司),L-DMEM(Gibco),CCl4(天津化工厂),胰蛋白酶(宝泰克),DAPI(Sigma),ALT检测试剂盒(南京建成),白蛋白检测试剂盒(南京建成),总胆酸检测试剂盒(南京建成)。
1.1.3主要仪器净工作台BCM-1000A(国产),CO2恒温细胞培养箱(日本SANOY),低速离心机(北京医用离心机厂),相差倒置光学显微镜(Olympus),荧光显微镜(Nikon),冰冻切片机(Leica)。
1.2方法
1.2.1细胞培养4周龄健康SD雌性大鼠,无菌条件下迅速取出其股骨和胫骨,以L-DMEM冲出骨髓,制成单细胞悬液,缓慢加入到密度为1.077g/mL的percoll液中,体积比为1∶1,400g离心10min,吸取中间的白膜层,接种于含10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基中,置于37℃,5%CO2饱和湿度孵箱培养。72h首次换液,以后3d换液一次,细胞生长融合达80%时,用0.25%胰蛋白酶消化,1∶3传代培养。
1.2.2BMSCs的标记和记数取生长旺盛第三代BMSCs,培养液中加入DAPI(终浓度50μg/mL)孵育过夜,PBS洗涤培养瓶至少6次,以去除未与细胞结合的DAPI。胰酶消化制成细胞悬液,在荧光显微镜下,以340nm波长激发观察标记情况,调整细胞密度为106/mL后备用。
1.2.3肝硬化模型的制做体重250～300g健康雌性SD大鼠60只,诱导期以0.035%苯巴比妥钠溶液为其惟一饮用水,持续1周。成模期以40%CCl4植物油溶液0.3mL/100g的剂量皮下注射,首剂加倍,每周2次,持续4周,同时以10%酒精为惟一饮用水,以玉米面为其惟一饲料。从第5周开始以50%CCl4 植物油溶液0.3mL/100g皮下注射,以20%酒精为惟一饮用水。10周后随机宰3只大鼠,取肝脏组织做病理学检查,检验造模情况。
1.2.4BMSCs的移植取造模成功的肝硬化模型大鼠50只,随机分为对照组,门静脉移植组,肝脏局部移植组,脾脏局部移植组,尾静脉移植组。术前2h给予青霉素40万U/kg肌肉注射,予1%戊巴比妥60mg/kg腹腔内麻醉,对照组仅行开腹术;经尾静脉移植组经尾静脉注射DAPI标记的BMSCs悬液1mL之后,行开腹术;其余三组开腹后分别经肝脏、脾脏、门静脉注射DAPI标记的BMSCs悬液1mL。压迫注射点5min后,无出血后,逐层关腹。术后青霉素40万U/kg肌肉注射3d,预防感染。
1.2.5检测ALT、TBIL、ALB术后各组大鼠仍然以0.3mL/100g的维持剂量皮下注射40%CCl4 植物油溶液,予正常饮食喂养。3周后处死所有实验动物,取其静脉血检测ALT、TBIL、ALB,取肝脏做冰冻切片,荧光显微镜下观察移植率。
1.3统计学分析
所有数据均采用均数±标准差表示,采用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。用Levene检验方差齐性,如果符合方差齐性,则采用LSD-t检验,如果不符合,则采用Kruskal-Wallis检验,P0.05)。见表1。
3讨论
BMSCs具有极强的自我修复和多向分化的潜能,且来源广泛,容易获取。Sato等[2]的研究表明骨髓间充质干细胞在应用于向肝细胞诱导方面为最为理想的种子细胞,BMSCs与组织工程相结合,利用其多向分化的潜能,用于治疗肝脏疾病有着广阔诱人的前景。
BMSCs作为种子细胞治疗肝脏疾病的移植途径有肝脏注射法、脾脏注射法、门静脉注射法、外周静脉注射法。外周静脉注射法操作简便,但以往认为外周静脉移植较肝动脉或门静脉移植法定居到肝脏上的细胞比较少,本实验表明两种移植途径的疗效无显著性。其原因可能是脏器损伤后的细胞坏死引起一系列信号的释放,导致骨髓干细胞动员至外周血,损伤组织表达特异性受体引导对应的干细胞移动并黏附于损伤处,发挥组织修复作用。但也有研究表明,经静脉移植后的BMSCs在大脑、心脏、肺及全身多个部位均有发现,说明其向肝脏的定殖率不高,而且可能有潜在的副作用发生,所以不应推崇。
有关肝移植的研究表明,只有原位肝移植才能长久稳定的发挥作用。有关肝细胞移植的研究同样证实肝脏注射移植是最有效的移植途径。因为肝脏有最适合肝细胞生长的组织微环境,为相关基因的表达提供黏附因子;门静脉血液中含有促进肝细胞生长的很多营养性成份;而且肝脏空间广阔,可以承受较多量的细胞移植。经肝脏注射移植后,在肝脏相关黏附因子的作用下细胞很快进入肝窦,随血液循环进入身体其他部位的细胞数量很少,因而定殖率高而潜在的全身副反应小。但肝脏注射移植需多点注射,可能损伤到肝脏重要管道,而发生严重不良反应。本组实验中肝脏注射移植后并没有发生出血,门静脉压力升高等不良反应。
BMSCs修复肝脏的可能机制是:1.分化形成正常肝细胞,补充肝细胞数量,改善肝功能。2.BMSCs分泌多种细胞因子和生长因子,抑制炎症反应,促进肝细胞再生。3.直接抑制肝脏星形细胞(HSC)的活化,减少细胞外基质(ECM)的产生。Kim Wh等[3]将HSC与MSCs体外共培养后发现,HSC的增殖活性受到明显抑制。4.降解肝内过量的ECM。Sakaida等[4]实验证明MSCs通过高表达MMPs降解胶原纤维,逆转肝纤维化。5.细胞融合:研究证明MSCs可与肝细胞融合,然后启动细胞增殖分裂过程。6.激活受损肝细胞,启动内源性肝细胞分裂再生过程。Yannaki等[5]研究发现MSCs直接分化为肝细胞的数量有限,但能激发高效的肝细胞内源性增生。
本实验表明,通过肝脏注射途径移植BMSCs治疗肝硬化比经外周静脉,门静脉,脾脏注射更有优势,BMSCs移植治疗肝硬化的机制是多方面的,其发挥作用的主要机制仍需进一步研究。在向肝细胞分化的方向上,移植何种分化程度的BMSCs更能有效的促进肝功能恢复也需要深入探索。
[参考文献]
[1] Petersen BE,Bowen WC,Patrene KD,et al. Bone marrow is a potential source of hepatic oval cell[J]. Science,1999,284(5417):1168-1170.
[2] Sato Y, Araki H, Kato J, et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion[J]. Blood,2005,106(2):756-763.
[3] Kim WH,Matsumoto K,Bessho K,et al. Growth inhibition and apoptosis in liver myofibroblasts promoted by hepatocyte growth factor leads to resolution from liver cirrhosis[J]. Am J Pathol, 2005, 166(7):1017- 1028.
[4] Yamamoto N,Terai S,Watanabe T,et al. A subpopulation of bone marrow cells deplted by a novel antibldy,anti-Liv8,is useful for cell therapy to repair damaged liver[J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,313(4):1110-1118.
[5] Yannaki E,Athanasiou E,Xagorari A,et al.G-CSF-primed hematopoietic stem cells or G-CSF per se accelerate recovery and improve survival after liver injury,predominantly by promoting endogenous repair programs[J].Exp Hematol,2005,33(1):108-119.
(收稿日期:2009-10-23)
