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[摘要] 目的 研究薯蓣皂苷元对人宫颈癌细胞增殖的影响。方法 培养人宫颈癌细胞株Hela，不同浓度的薯蓣皂苷元干预24、48、72h，采用MTT、EdU检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期，Western Blot检测细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin B1。结果 薯蓣皂苷元在20μmol/L浓度时抑制Hela细胞活力（P＜0.01），呈现量效和时效特征；薯蓣皂苷元作用后EdU阳性细胞明显减少，薯蓣皂苷元引起G0/G1期细胞阻滞，减少S期细胞，降低Cyclin D1蛋白表达，而对Cyclin B1蛋白表达没有明显影响。结论 薯蓣皂苷元通过阻滞细胞G0/G1期来抑制人宫颈癌Hela细胞株的增殖。
[关键词] 薯蓣皂苷元；宫颈癌；细胞增殖；细胞周期
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）26-05-03
Influence of Diosgenin on Cell Proliferation in Human Cervical Cancer
ZHANG Wenxiu
Department of Obstetrics and Gynecology， the First People"s Hospital of Jining City， Jining 272100， China
[Abstract] Objective To evaluate the possible effects of diosgenin on cell proliferation in human cervical cancer. Methods The Hela cells were treated with different concentrations of diosgenin for 24， 48 and 72 hours， respectively. Cell proliferation was tested by MTT and EdU assay， and cell cycle analysis was performed by FACS. In addition， Cyclin D1 and B1 protein expressions were tested by Western Blotting， respectively. Results We found that 20 μmol/L diosgenin began to markedly inhibit cell viability （P＜0.01） and there were dose-dependent and time-dependent effects of diosgenin on cell viability. We found that the number of EdU+ cells （EdU-labeled replicating cells） was significantly reduced in diosgenin treatment group. Diosgenin decreased expression of cyclin D1 and arrested them at the G0/G1 phase. Conclusion Diosgenin inhibits the proliferation of human cervical cancer cells by blocking them at the G0/G1 phase.
[Key words] Diosgenin； Cervical cancer； Cell proliferation； Cell cycle
现代药理研究表明薯蓣皂苷及其衍生物具有免疫调节、降血脂、抗衰老、抗氧化、抗关节炎、保护胃黏膜、祛痰、溶血、脱敏、灭钉螺、抗肿瘤、抗艾滋病、抗血小板聚集、增强心脏收缩力、减慢心率、抗动脉硬化、改善微循环等多种药理活性[1，2]。宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升和年轻化趋势；近年来，国内外对化疗在宫颈癌的应用进行基础和临床方面研究，取得较大进展。本研究观察薯蓣皂苷元对人宫颈癌Hela细胞株增殖和细胞周期的影响，探讨其对治疗宫颈癌的可能作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
人宫颈癌细胞株购自上海瑞齐生物科技有限公司，用含10%新生牛血清（NBS，Gibco，USA）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素、2mmol/L谷氨酰胺的DMEM培养基（Gibco，USA）培养；细胞培养孵箱内培养条件：5%CO2，95%空气，温度37℃，湿度98%。细胞在培养皿中密度达到70%～80%时，进入实验干预。
1.2 薯蓣皂苷元贮存液配制
原粉为美国Sigma公司产品，按照说明书要求，溶于酒精配制100mM贮存液，无菌分装-80℃保存备用。工作液酒精浓度0.5%。分组实验，无菌吸取贮存液加入饥饿培养液中，稀释为15μM、20μM、25μM、30μM。
1.3 细胞活力的测定
细胞密度培养至70%～80%，消化后转至96孔板（每孔细胞数约1×104），含10% NBS的DMEM培养基培养2～3d，含0.2% NBS的DMEM培养基培养（同步化）24h，之后进入实验干预阶段。对照组与薯蓣皂苷元15μM组、20μM组、25μM组、30μM组，分别作用24h、48h和72h；采用MTT方法检测细胞活力（中国凯基，MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒）。Dilution Buffer将5×MTT稀释成1×MTT；每孔加1×MTT 50μL，37℃孵育4h，MTT还原为甲�；吸出上清液，每孔加DMSO 150μL溶解甲�，平板摇床摇匀；酶标仪在550nm波长处检测每孔的光密度。
1.4 细胞增殖的检测
取对数生长期细胞，以每孔6000～10000细胞接种于96孔板，置培养箱培养过夜；根据实验需要进行药物处理，对照组与25μM薯蓣皂苷元作用6h、12h；采用EdU试剂盒（中国锐博，C00031 Apollo®567）检测细胞增殖，荧光显微镜下所有细胞核显示蓝色（Hoechst染色），增殖中的细胞核显示红色（EdU染色）。
1.5 细胞周期检测
对照组与25μM薯蓣皂苷元作用24h、48h；细胞干预消化结束，PBS洗后离心，0.4mL PBS重悬细胞转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎），加50μL PI至终浓度为65μg/mL，冰浴中避光染色30min；300目（孔径40～50μm）尼龙网过滤，流式细胞仪检测细胞周期。
1.6 Cyclin D1、Cyclin B1蛋白表达水平检测
对照组与25μM薯蓣皂苷元作用6h、12h；细胞贴壁生长于直径4cm的培养皿，分组培养不同时间后提取蛋白，测定蛋白浓度，采用Western Blot检测Cyclin D1、Cyclin B1蛋白表达水平。抗体：小鼠单克隆β-actin一抗（Abcam，6926），小鼠抗人Cyclin D1单克隆抗体（sc-8396），兔抗人Cyclin B1单克隆抗体（Abcam，4138），山羊抗小鼠-HRP标记抗体（ZB2305）购自北京中杉公司，小鼠抗兔-HRP标记抗体购自Cell Signaling公司。
1.7 统计学处理
所有实验重复3次以上，采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，计量资料用均数±标准差（χ±s）表示，组间均数比较采用方差分析与t检验。检验水平α=0.05。
2 结果
2.1 MTT结果
20μmol/L薯蓣皂苷元作用24h后，开始明显抑制宫颈癌Hela的细胞活力（P＜0.05），呈现量效和时效的影响，随着薯蓣皂苷元浓度增加和作用时间的延长，抑制效果明显增强。根据MTT结果和参考文献，选用25μmol/L浓度的薯蓣皂苷元进行以下实验。见图1。
图1 不同浓度薯蓣皂苷元对人宫颈癌细胞株Hela细胞活力的影响
2.2 EdU结果
EdU阳性细胞数（即增殖期细胞）在薯蓣皂苷元处理6h和12h后明显减少；作用12h EdU阳性细胞数减少更明显。见图2。
2.3 流式细胞仪检测细胞周期
25μmol/L薯蓣皂苷元阻滞细胞在G0/G1期，S期细胞减少（P＜0.05）；G2/M期细胞没有明显变化。作用24h和48h，两者之间无明显差异。见表1。
2.4 Western blot检测结果
25μmol/L薯蓣皂苷元作用6h后对Cyclin D1蛋白水平无明显影响；作用12h后降低Cyclin D1蛋白的水平；Cyclin B1蛋白水平无明显变化。见图3。
图3 薯蓣皂苷元对细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin B1的影响
3 讨论
子宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤，传统的治疗方案认为宫颈癌对化疗药物不敏感，仅在晚期和复发患者中将化疗作为综合治疗一部分。近年来大量基础和临床研究表明，化疗在宫颈癌的治疗中，对局部治疗手段不能控制的肿瘤周围、肉眼看不到的微小转移灶以及可能存在的全身亚临床转移有一定疗效，进而确定化疗在治疗宫颈癌的地位。化疗药物通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡起到抗肿瘤作用，因此寻找新的抑制宫颈癌细胞增殖或诱导凋亡的药物，成为治疗宫颈癌的新策略。
国外研究表明薯蓣皂苷元具有显著抗增殖和诱导凋亡作用。体内抗肿瘤的效用方面，Malisetty等[3]报道在啮齿动物结肠癌模型中，薯蓣皂苷元在起始、始发、进程中能够抑制结肠癌前病变，表明它可以有效推迟和终止结肠癌前病变的出现和发展。Raju等[4]研究也证实，薯蓣皂苷元阻止结肠癌变早期阶段的进程。此外，体外抗肿瘤效用方面，Shishodia等[5]检测体外的薯蓣皂苷元对60种人类肿瘤细胞系/株的细胞毒作用，结果显示薯蓣皂苷元的细胞毒作用可对抗NCI人类肿瘤的白血病、实体瘤等大多数细胞株。MTT结果提示薯蓣皂苷元抑制宫颈癌Hela细胞活力，15μmol/L薯蓣皂苷元作用24h后不能明显抑制细胞活力，20μmol/L薯蓣皂苷元作用24h开始明显抑制宫颈癌Hela的细胞活力，随着浓度增加抑制作用更加明显，呈现量效和时效作用；根据MTT和其他文献结果，采用25μM薯蓣皂苷元进行EdU实验及下一步实验，进一步证明其抑制宫颈癌Hela细胞株增殖的作用。
Cyclin D1在G1/S期转换过程中起重要作用，是细胞DNA合成以及通过G1/S期检测点的正向调控因子；Cyclin B1是典型G2/M期周期蛋白，促进细胞从G2期进入M期完成有丝分裂。研究结果表明薯蓣皂苷元阻滞细胞G0/G1期，减少S期细胞；25μmol/L薯蓣皂苷元作用6h对Cyclin D1蛋白水平无明显影响，作用12h和48h后Cyclin D1蛋白水平降低；薯蓣皂苷元对Cyclin B1蛋白水平影响无明显差异，与相关文献报道一致。
综上所述，薯蓣皂苷元能抑制宫颈癌Hela细胞株增殖，通过降低Cyclin D1蛋白表达而引起G0/G1期细胞阻滞，薯蓣皂苷元抑制增殖作用有明显的量效和时效影响。遗憾的是，由于时间所限制没有进行相关细胞信号通路的研究，我们将在下一步实验，重点研究薯蓣皂苷元影响宫颈癌Hela细胞株的信号通路。
[参考文献]
[1] McAnuff MA，Harding WW，Omoruyi FO，et al. Hypoglycemic effects of steroidal sapogenins isolated from Jamaican bitter yam. Dioscorea polygonoides[J]. Food Chem Toxicol，2005，43（11）：1667-1672.
[2] Turchan-Cholewo J，Liu Y，Gartner S，et al. Increased vulnerability of ApoE4 neurons to HIV proteins and opiates： protection by diosgenin and L-deprenyl[J]. Neurobiol Dis，2006，23（1）：109-119.
[3] Malisetty VS，Patlolla JMR，Raju J，et al. Chemoprevention of colon cancer by diosgenin， a steroidal saponin constituent of fenugreek[J]. Proc Amer Assoc Cancer Res，2005，46：2473.
[4] Raju J，Patlolla JM，Swamy MV，et al. Diosgenin， a steroid saponin of Trigonella foenum graecum （Fenugreek）， inhibits azoxymethane-induced aberrant crypt foci formation in F344 rats and induces apoptosis in HT-29 human colon cancer cells[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13（8）：1392-1398.
[5] Shishodia S，Aggarwal BB. Diosgenin inhibits osteoclastogenesis， invasion， and proliferation through the downregulation of Akt， I kappa B kinase activation and NF-kappa B-regulated gene expression[J]. Oncogene，2006，25（10）：1463-1473.
（收稿日期：2011-08-01）
