【www.zhangdahai.com--效能建设心得体会】
郑娴娴,葛魏巍
克罗恩病病(Crohn′s disease,CD)病因未明,可能与环境因素亦或肠道菌群参与下的免疫紊乱等因素有关[1]。病情反复，可累及整个消化道，其中30%患者病变仅局限于小肠称为小肠克罗恩病病(small bowel Crohn′s disease,SBCD)[2]，目前尚无根治的方法。近年来，由于多种检查方法的应用[3-6]，小肠克罗恩病的早期诊断率有所提升，然而对于非穿孔或非狭窄的小肠克罗恩病早期发现率仍较低[7]。因此，如果能从分子水平揭示疾病发生的机制，寻找分子治疗靶点，并为疾病的诊断提供分子标志物，将会大大提高患者生活质量[8]。本研究挖掘GEO数据库中有关小肠克罗恩病的相关数据，利用生物信息学方法构建miRNA-mRNA调控，并筛选关键致病基因，从分子水平上探寻小肠克罗恩病的发病机制并为分子治疗提供理论依据。
1.1 资料来源
GEO数据库(https://www.ncb i.nlm.nih.gov/geo/)收录了世界各国研究机构提交的高通量基因表达数据。本研究从GEO数据库中检索克罗恩病的表达谱芯片，选取小肠黏膜及正常小肠黏膜的表达数据，最终选定GSE102127用于差异表达miRNA(DEMs)的筛选、GSE20881、GSE75214、GSE102133经数据融合及批次校正后用于筛选差异表达基因(DEGs)及诊断效能分析，数据集对应的检测平台及样本数见表1。GEO数据完全公开，因此本研究无需伦理委员会审查。
表1 GEO数据库样本
1.2 研究路线
1.3 生物信息学分析
1.3.1 转录组数据差异分析及可视化 GSE102127数据集利用GEO数据库的在线分析软件，设定过滤条件adj.P.Val<0.05且|logFC|>1，筛选DEMs。GSE20881、GSE75214、GSE102133三个数据集首先进行融合，经批次校正后利用perl软件(https://www.perl.org/)将探针ID转换为对应的基因名称；
采用R语言(https://www.r-project.org/)的“limma”包进行DEGs的筛选，设定过滤条件为adj.P.Val<0.05且|logFC|>2，并后续进行GO (Gene Ontology) 富集和 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书) 富集分析。
图1 研究路线图
1.3.2 miRNA-mRNA调控网络构建 利用FunRich(version 3.1.3 http://www.funrich.org/)软件对差异表达的miRNA进行靶基因预测，筛选出符合以下条件的miRNA及mRNA进行调控网络的构建：①miRNA及mRNA在各自数据集中均差异表达；
②miRNA及mRNA呈负相关。调控网络利用Cytoscape(https://cytoscape.org/)软件进行可视化。
1.3.3 功能注释及可视化 融合后的数据集中DEGs利用R语言进行GO富集和 KEGG通路功能注释。GO 富集分为分子生物学功能(molecular function, MF)、生物学过程(biological process, BP)和细胞学组分(cellular components, CC)三大类。KEGG 是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库，被广泛用于基因通路的富集注释。设置筛选参数为Pvalue cutoff =0.05且q value cutoff = 0.05为具有统计学意义。
1.3.4 关键基因筛选及诊断效能分析 将融合后的数据集中DEGs通过String(https://string-db.org/)数据库进行分子蛋白互作网络分析，并将网络结果导入Cytoscape软件(版本号3.9.0)，基于“cytohubba”模块中“Degree”、“MCC”、“Betweenness”算法筛选排名前10的关键基因，取交集后得到关键基因，并通过ROC曲线分析关键基因的诊断效能。
1.4 统计学分析
利用受试者工作特征曲线评价关键基因对小肠克罗恩病的诊断效能，P<0.05有统计学意义。
2.1 转录组数据分析结果
GSE3102127数据集经在线分析后得到DEMs15个，9个表达上调，6个表达下调。经FunRich软件预测后得到2699个可能调控的靶基因。GSE20881、GSE75214、GSE10213三个数据集经融合及批次校正后，利用R语言“limma”包筛选出DEGs 273个，其中上调基因66个，下调基因207个，具体见图2。
2.2 miRNA-mRNA调控网络构建结果
基于miRNA-mRNA 负向调控原理，结合FunRich软件预测结果，本研究共筛选出38个调控轴用于调控网络构建，其中miRNA 11个，mRNA34 个，调控网络构建结果见图3。
2.3 差异表达基因功能注释结果
将273个DGEs进行功能注释分析，GO富集在白细胞迁移、中性粒细胞迁移等生物过程；
KEGG富集注释表明差异基因主要参与IL-17、肿瘤坏死因子等信号通路，见图4，图5。
图2 差异表达mRNA火山图，红色表示上调，绿色表示下调
图3 miRNA-mRNA 调控网络，三角代表miRNA，圆形代表mRNA，红色表示上调，黄色表示下调
图4 GO富集结果
2.4 关键基因筛选及诊断效能分析
将273个差异表达的mRNA 导入String网站，进行蛋白互作网络分析，最低互动分数>0.700时共得到157个节点，538条边，具体见图6。将String网站数据导入Cytoscape软件，cytoHubba模块下基于“Degree”、“MCC”、“Betweenness”算法筛选排名前10的关键基因，取交集后得到4个关键基因(图7)，分别为IL6、IL1B、MMP9 及ICAM1。受试者工作特征曲线分析以上4个关键基因中仅MMP9可用于诊断小肠克罗恩病，其P值为0.025，AUC为0.361，敏感性100%，特异性31%，具体见图8。
图5 KEGG富集结果
图6 DEGs蛋白互作网络图
图7 关键基因筛选结果
SBCD缺乏特异性临床表现，同时小肠镜检查普及程度不一，因此患者从症状出现到发现病灶历时较长，诊断较为困难[9-10]。目前，有关SBCD的发病机制尚不明确，可能与免疫功能紊乱、遗传、环境等因素等有关，治疗上仍缺乏有效药物[11]。因此，从分子水平探究小肠克罗恩病的发病机制及寻找治疗靶点是目前研究的一个方向[12-14]。本研究借助生物信息学技术，分析了GEO数据库中有关CD小肠黏膜转录组表达数据。研究结果表明miRNA及mRNA在正常小肠黏膜及病变黏膜组织中均差异表达。为增加致病基因筛选的可信性，我们将3个mRNA数据集进行融合，扩大样本量，经R语言处理后筛选出DEGs 273个，其中上调基因66个，下调基因207个，联合miRNA筛选结果我们成功构建出38个调控轴，为SBCD的分子调控研究提供了理论依据。
图8 IL6、IL1B、MMP9 、ICAM1诊断小肠克罗恩病ROC曲线
针对273个DEGs，我们进行了GO富集分析，注释结果表明DEGs参与了白细胞迁移、中性粒细胞迁移、细胞趋化性等生物过程。白细胞迁移是启动炎症免疫反应的重要的步骤之一，过程相当复杂。在体内，通过抑制白细胞迁移有望治疗炎症性肠病/克罗恩病、多发性硬化症和类风湿性关节炎等疾病。既往研究同样表明克罗恩病患者中性粒细胞迁移受损与趋化因子的产生减少有关，通过粒细胞集落刺激因子治疗后病情有所缓解[15]。而KEGG注释则表明DEGs参与IL-17、肿瘤坏死因子(TNF)、类风湿性关节炎等信号通路。IL17细胞因子家族由6个配体组成，IL17A到IL17F，是Th17细胞产生的关键细胞因子。IL17信号通路能够诱导TNF、IL22、IL1β和脂多糖等促炎分子的产生，从而导致黏膜免疫系统的过度激活和异常的细胞因子反应[16]。TNF是由157个氨基酸亚基组成的同源三聚体，主要由活化的巨噬细胞以可溶性或跨膜形式产生，通过与两个膜受体TNFR1和TNFR2的相互激发来发挥作用。在炎症过程中，TNF是炎症级联反应后期的关键介质。除了促炎功能，TNF在维持肠道菌群与黏膜免疫系统之间的稳态平衡中同样发挥作用，积极参与肠道屏障功能[17]。在炎症过程的早期阶段，TNF对肠道黏膜有保护作用，而在疾病的晚期阶段，TNF则发挥促炎作用[18-19]。以上情况表明DEGs在肠道菌群平衡、肠黏膜屏障功能及肠道免疫等方面参与了小肠克罗恩病的发生发展过程。
我们通过String网站对差异表达的mRNA 进行蛋白互作网络分析，最低互动分数>0.700时共得到157个节点，538条边，经Cytoscape软件，筛选出IL6、IL1B、MMP9 及ICAM1为关键基因。IL6、IL1B作为炎性细胞因子和炎性反应介质，可破坏肠黏膜屏障，导致肠黏膜肠黏膜渗出、增生，组织损伤[20-21]。在动物模型中，抗 IL-6R 单克隆抗体通过抑制血管内皮粘附分子表达而用于治疗肠道炎症性疾病[22]。基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP 9)是一种依赖金属锌离子的金属酶，主要来源于单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，具有降解细胞外基质和触发炎症等作用。既往多项研究发现MMP9水平升高与CD患者的疾病活动密切相关，可用于评估疾病活动程度[23-24]。细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)，属于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的一员，是介导黏附反应的一个重要黏附分子，在促进炎症部位黏连、调节机体免疫反应中起重要作用。通过与其受体的特异性结合，增强炎症细胞与内皮细胞间的黏附作用，促使炎性细胞向炎症部位迁移，参与CD的肠道炎症过程。国内学者研究发现CD 患者血浆中ICAM-1水平与疾病严重程度密切相关，与年龄、病变部位等临床特征无明显关联[25]。
本研究筛选的4个关键基因均参与了SBCD的发生、发展的过程，证实了利用生物信息学技术寻找疾病相关致病基因的可行性。由于SBCD早期诊断相对困难，为进一步探讨关键基因能否早期诊断SBCD，我们利用ROC曲线分析其诊断效能，ROC结果显示4个关键基因中仅MMP9可用于SBCD的诊断，其P值为0.025。然而MMP9的诊断效能偏低，其AUC为0.361，且特异性欠佳，仅为31%。从ROC分析结果可以看出目前SBCD的诊断很大程度上仍取决于临床医师的经验及胶囊内镜、气囊辅助小肠镜等辅助检查，从分子水平上寻找SBCD早期诊断生物标志物仍是未来我们研究的方向。
综上所述，我们利用多芯片联合分析的方法筛选了SBCD患者DEGs，这些差异基因在肠道菌群失衡、肠黏膜屏障功能、炎性细胞迁移及肠道免疫等方面参与了小肠克罗恩病病的发生发展过程。虽然目前差异基因尚无法作为SBCD诊断的分子标志物，然而我们构建的miRNA-mRNA调控网络为SBCD的分子治疗提供了理论依据及未来可能的分子靶点，以期从分子水平上达到治愈SBCD的目的。
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