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【摘要】 目的 建立裸鼠前列腺癌骨转移模型，探讨塞来昔布作为血管抑制剂对前列腺癌骨转移的形成及生长的影响。方法 将30只前列腺癌骨转移裸鼠随机分成二组，第一组隔日予以生理盐水，腹腔注射；第二组隔日予以塞来昔布30 mg/kg，腹腔注射； 30 d后处死。检测血清碱性磷酸酶，采用免疫组化和图象分析系统测定血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤微血管密度(MVD)，光镜下观察各组肿瘤组织,流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果 治疗组肿瘤的生长明显受到抑制(P1］。塞来昔布是一种新型的非甾体类抗炎药，因具有抗血管生成及诱导肿瘤细胞凋亡的作用而引起人们的关注。关于其单独应用对前列腺癌骨转移瘤生长影响的研究目前尚未见报道，本实验对此进行初步探讨。�
1 材料和方法�
1.1 主要试剂和材料
blab�c种系裸鼠，SPF级，鼠龄4~8周，雌性，体重15~20 g，共30只，购于湖北省防疫站，在武汉大学动物实验中心SPF环境中饲养。人前列腺癌细胞系PC�3购于中科院武汉生物保存中心。VEGF抗体、鼠抗人Ⅷ因子抗体购于北京中山公司。�
1.2 前列腺癌骨转移动物模型建立2］
前列腺癌单细胞悬液采用PC�3细胞，用PBS调节细胞浓度到1×10��7�个/ml。裸鼠用戊巴比妥钠麻醉,75%乙醇消毒股骨及胫骨处皮肤后，用4.5号针头直接于股骨髁上刺透骨皮质,然后将针尖插入骨干内注入0.1 ml的单细胞悬液。�
1.3 动物分组与标本处理
将接种之后的裸鼠30只随机分为2组，每组15只。24 h后给药，第一组(对照组)：隔日腹腔注射生理盐水；第二组(塞来昔布组)：隔日腹腔注射塞来昔布30 mg/kg。30 d后断颈处死裸鼠，处死之前每只摘眼球放血以检测血清碱性磷酸酶的含量；脊椎离断处死后连同包膜完整剥出肿瘤组织，电子天平称重，游标卡尺测量肿瘤长径和短径，按下列公式计算体积和抑瘤率。�
V=a×b��2�/2(V代表肿瘤体积，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径)�
抑瘤率=(对照组肿瘤体积�实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%�
1.4 免疫组织化学染色及结果判断
肿瘤组织置于10%中性甲醛中固定24 h，石蜡包埋，连续切片(4 μm)，行VEGF和MVD免疫组化染色,以PBS代替一抗作阴性对照。�
1.4.1 VEGF判断标准 高倍镜视野下计数100个细胞，胞浆棕黄的阳性细胞少于5%为阴性，多于或5%为阳性。采用病理教研室CMIAS真彩图形分析系统对VEGF的表达进行定量分析。�
1.4.2 MVD判断标准3］ 选用40×镜扫视整个切片，寻找高血管密度区，然后计数1个200×视野的染成棕色的血管环(条)数目(任何染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇，只要它和邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就把它看作1个微血管。由两名高年资病理医师分别计数3个200 视野下的血管数目，取两者的平均值)。�
1.5 流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡
新鲜的肿瘤组织采用EDTA螯合法制备成单细胞悬液。然后经70%乙醇固定，过滤，离心，PI染色，在流式细胞仪上用MultiCycle for Windows软件作细胞周期分析。�
1.6 统计学处理
所有数据采用均数±标准差(x±s)表示，各组均数比较采用单向方差分析，P0.05)。瘤重方面：治疗组与对照组比较差异有统计学意义(P0.05,vs.Control; ��b�P>0.05,vs.Control;��c�P 2.5 光镜下肿瘤细胞形态
镜下可见对照组肿瘤细胞排列密集，核大小不一，染色深，病理性核分裂象异常增多，异型性明显，瘤细胞密度高；而塞来昔布组镜下可见病理性核分裂象较对照组明显降低，异型性没有对照组高，肿瘤细胞变性和坏死较对照组明显严重，核固缩和碎裂易见，瘤细胞密度相对空白组也有显著下降。�
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图4
光镜下细胞凋亡形态
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3 讨论�
用胫骨髓腔注射法制备骨转移模型4，5］。这种方法具有很高的骨转移形成率。术后第2周即可通过影像学检测到局部的骨质破坏，结合组织病理学和免疫组织化学方法证实其骨转移率为100％。该模型形成的骨转移灶增殖快；3～4周即突破胫骨骨皮质，局部形成肉眼可见的瘤体，便于观察。�
塞来昔布组的瘤重与空白组有显著差异,抑瘤率为54.47%。说明塞来昔布有效地抑制了转移瘤的生长。塞来昔布是一种高选择性的非甾体类抗炎药(nonsteroidal anti�inflammatory drugs,NSAID)，能选择性抑制COX�2，而对COX�1几乎没有作用，而其对转移瘤的抑制作用可能与塞来昔布高选择性抑制COX�2有关13］。目前研究认为COX�2作为抗肿瘤治疗靶点的机制可能是：① COX�2依赖性途径6，7］诱导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的生长。② COX�2诱导血管内皮生长因子(VEGF),NO合酶，血管生成素I受体等促血管因子的表达从而影响肿瘤血管生成。其中VEGF是重要的血管内皮生长因子，它能刺激血管增生，调节血管通透性，能促进肿瘤周围及内部形成新生的血管并促进肿瘤血道转移8，9］。它在多种恶性肿瘤组织内均有过量表达。本研究结果显示塞来昔布组癌组织的VEGF和MVD的表达均较对照组显著降低，这提示塞来昔布的抗瘤作用主要是通过减少肿瘤组织中VEGF的分泌来抑制肿瘤组织新生血管的形成，使肿瘤组织血管数目减少，血管通透性降低，肿瘤细胞得不到充足的氧和营养物质，从而抑制肿瘤的生长。�
参 考 文 献�
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