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【摘要】 目的 通过对蛋白免疫印迹法(WB)试验结果的观察,确定个体是否感染HIV以及HIV感染的状况。方法 对60份抗-HIV初筛阳性血清使用蛋白免疫印迹法(WB)进行确认实验。结果 在被检测样品中,HIV-1型确认试验阳性54例,占90%;HIV-1型确认试验阳性,且提示HIV-2阳性感染1例,占1.6%;HIV-1型确认试验弱阳性(不确定)3例,占5%;HIV-1型确认试验阳性2例,占3.3%。结论 蛋白免疫印迹法(WB)试验确定个体有无HIV感染以及HIV感染情况提供依据。
【关键词】 HIV感染;蛋白免疫印迹法(WB);条带
【Abstract】 Objective Through to western blot assay observation of result of the test, confirm individual infect HIV and HIV infect the state.Methods Safe the positive serum and use western blot assay to confirm to cases of 60 persist-HIV positive for the first time.Results Being measured in the sample, HIV-1 types confirm testing 54 cases of positive,takes 90%.HIV-1 types confirms testing positive,and point outHIV-2 infect one positively,takes 1.6%.HIV-1 types confirm testing weak positive 3,takes 5% HIV-1 type confirm testing negative 2,take 3.3%.Conclusion Western Blot Assay test offers basis on confirm whether individuals have HIV is infected and HIV infect the state.
【Key words】 HIV infect;Western Blot Assay;Strip
作者单位:455000河南省安阳市肿瘤医院检验科
艾滋病(AIDS)是一种目前尚无有效治愈方法,病死率极高的传染病,它在全世界的广泛流行已经成为严重的公共卫生问题和社会问题。截止到2007年7月底,我们对60名抗-HIV初筛阳性者进行了蛋白免疫印迹法(WB)确认实验,通过实验结果(蛋白带条)的观察,探讨与HIV感染关系,并且还可以在监控病情进展,观察治疗结果,综合监测和行为干预等方面起到重要作用,现将结果报告如下。
1 试剂与方法
1.1 试剂 人类免疫缺陷病毒(HIV 1+2)型抗体免疫印迹试剂盒(新加坡健利检验诊断私人有限公司提供)。
1.2 仪器 脱色摇床:江苏TS-1。
1.3 方法 过夜孵育法
1.3.1 试剂的配制
1.3.1.1 稀释洗涤缓冲液 将1体积的浓缩洗涤缓冲液(20X)加入到19倍体积的双蒸馏水中,充分混匀。
1.3.1.2 封闭缓冲液 1体积的浓缩样品稀释缓冲液加入到9倍体积的双蒸馏水中,充分混匀,每毫升加入1 g封闭粉,充分混匀。
1.3.1.3 酶结合物工作溶液 按1:1000比例,用上述配好的封闭缓冲液稀释酶结合物。
1.3.2 试验步骤:
1.3.2.1 用镊子小心取出需要的试剂膜,有号码的一端向上,分别放入孵育板槽内。强阳性对照、弱阳性对照、阴性对照各一条。
1.3.2.2 每槽内加入2 ml稀释的洗涤缓冲液,在室温下(25±3)℃将孵育板置摇床上振荡孵育至少5 min,以吸引器吸出缓冲液。
1.3.2.3 在每槽中加入2 ml上述配好的封闭缓冲液,随后分别加入2 ml患者血清和强阳性、弱阳性、阴性对照。
1.3.2.4 盖上盖子,于室温下(25±3)℃在摇床上过夜(16～20 h)振荡孵育。
1.3.2.5 小心掀开盖子以避免溅出或样品交叉,以吸引器吸出反应液。不用的样品槽间需要更换吸头以避免交叉污染。
1.3.2.6 每槽中加入2 ml的洗涤缓冲液,每次置摇床上振荡5 min。弃洗液,再重复两次。
1.3.2.7 每槽中加入2 ml酶结合物工作液,盖上盖子,于室温下(25±3)℃在摇床上振荡孵育30 min。
1.3.2.8 仔细打开盖子,吸出酶结合物溶液,按步骤6洗涤3次。
1.3.2.9 每槽中介入2 ml底物液,盖上盖子,于室温下(25±3)℃在摇床上振荡孵育15 min。
1.3.2.10 小心打开盖子,吸出底物,以双蒸馏水洗涤3次,以终止反应。
1.3.2.11 用镊子小心取出试剂膜,放在滤纸上,吸干水分,观察并记录结果。
2 结果
60份抗-HIV初筛阳性(WB)确认试验结果
表1
60份抗-HIV初筛阳性(WB)确认试验结果
份数条带形式结果
1只检测出p17抗体,没有其他条带阴性
1没有出现病毒的特异性条带,只出现质控带阴性
55检测出gp160、gp120、p24、p55、p17、p31、p5、p66HIV-1型阳性
1检测出sp160、gp41、gp120、p24、p17、p51、p66且HIV-2特定带清晰可见HIV-1型阳性
只检测出gp160和p24且提示HIV-2阳性可能
1只检测出gp160和p24、p17不确定
1不确定
3 结果和讨论
3.1 HIV通过各种途径进入机体后,病毒通过黏附,穿透细胞,复制等过程完成感染。此时,检测抗-HIV常呈阳性。蛋白条带会出现gp160、gp4、gp120、p17、p24、p55、p31、p51、p66。P55抗原分子是一种前体分子,在HIV感染早期出现并渐渐地分解成其他核蛋白。Gp160是前体分子,在感染初期产生,然后分解成gp120与gp41。Gp41蛋白分布在病毒包膜的内外层(跨膜糖蛋白),与HIV-1分型有关。Gp41与gp160共同参与病毒与病毒与宿主细胞CD4分子变体结合。在检测到gp160和p55时,说明病毒正在复制过程中。POL戴白包括p66、p51和p31,POL戴白位于病毒的核区内,与病毒核酸紧密相关联。病毒感染最初阶段,ENV(gp160)或GAG(p24)可单独出现,在感染初期30 d,p24与gp160的强度大约会相等,当病毒感染2～3个月时是,ENV和GAG标记物饱和,gp160在6个月内可饱和。随着时间的推移,病毒过了相关的“停滞期”,开始大量复制,这时出现典型蛋白条带。
3.2 当一个人最近处于血清学转型时期,很可能在测定时出现不典型条带类型。处于低感染的人群,有可能出现“不确定”结果。有时“不确定”反应是由于HIV-2型的交叉反应所致,比如gp120、p60。有些与HIV-2型感染有交叉反应。个别HIV-1型感染也可出现。这是因为艾滋病的自然病种或其他的免疫缺陷所致。p24和p66的抗体会随着艾滋病的病程进展而降低。另外,患有恶性肿瘤的感染者和接受免疫抑制药物治疗的感染这也有可能不出现阳性反应。当出现“不确定”结果时,建议感染者3～6个月进行复检,或检测病毒核酸或p24抗原,以作为辅助诊断。
3.3 当p17出现时,常伴有p24出现,仅p17出现无临床意义。当单独出现p68、p56、p40、p34时,可排除HIV感染。对于反复冻融的血清,ELIAS法检测抗-HIV常呈阳性,同时胶体硒快速诊断也呈阳性,而WB成阴性结果。在我们所检测的样品中就有1例,其中影响因素有待探讨。
参 考 文 献
[1] 全国艾滋病检测技术规范.中国疾病预防中心,2004,8:3-8.
[2] 传染病培训教材.安阳市卫生局,2003,4:22-28.
