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【摘要】 目的 研究小干扰RNA-siRNA对人甲状腺癌SW579细胞STAT3表达及细胞增殖和侵袭的抑制作用。方法 将STAT3-siRNA转染给人甲状腺癌SW579细胞来沉默STAT3的表达。用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blotting 测定STAT3 mRNA和蛋白的表达。用甲基噻唑基四唑(MTT)来分析STAT3 STAT3-siRNA对癌细胞的生长抑制作用。通过RT-PCR检测MMP2和MMP9 mRNA的表达,Transwell侵袭小室实验研究癌细胞的体外侵袭能力。结果 STAT3-siRNA能有效而稳定地抑制甲状腺癌SW579中STAT3的表达,下调STAT3可以在体外显著抑制肿瘤细胞的生长,在转染后24、48、72 h,转染STAT3特异性的siRNA组生长抑制率显著高于对照组。siRNA沉默STAT3基因后,肿瘤细胞的体外侵袭能力明显下降。结论 下调STAT3可以在体外显著抑制肿瘤细胞的生长和侵袭能力,STAT3特异性siRNA作为一种治疗肿瘤的新途径值得进一步研究。
【关键词】 STAT3-siRNA;甲状腺;肿瘤学
Inhibition effect of down regulation of STAT3 by RNAi on proliferation and invasion of human thyroid carcinoma cell line SW579
WANG Bo,ZHAO Wen-xin.
Department of General Surgery, Union Hospital, FuJian Medical University, FuJian 350001, China
【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of small interfering RNA on the expression of STAT3 and proliferation and invasion in human thyroid carcinoma cell line SW579. Methods Small interfering RNA was transfected into SW579 cells to knockdown the STAT3 expression. mRNA and protein levels of STAT3 were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot . The proliferation inhibition was determined by MTT assay.The expression of MMP2 and MMP9 mRNA were detected by RT-PCR and Transwell chambers were used to detect the invasive ability of cells in vitro. Results RNA interference efficiently and stably suppressed the STAT3 expression in STAT3 cells, and down regulation of STAT3 resulted in significantly inhibition of tumor cell growth in vit ro. At 24, 48, 72 h after thetransfection, the growth inhibitory rates were significantly higher in specific STAT3 siRNA group than those in the control. Transwell showed that invasive ability of cells were significantly suppressed after transfection of the siRNA vector into SW579 cells. Conclusion Down regulation of STAT3 results in significant inhibition of tumor growth and suppress the invasion in vitro. The use of STAT3 specific siRNA deserves further investigation as a novel approach to cancer therapy in the future.
【Key words】 STATs;siRNA; Thyroid; Oncology
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(项目编号:2009J01146);福建省医学创新课题资助(项目编号:2009-CXB-19)
作者单位:350001福建医科大学附属协和医院普外科
信号转导子与转录激活子家族(signal transducers and activators of transcription, STATs)是一类由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子,参与调节人体免疫反应、炎症反应和细胞的生长、分化等。近年研究表明[1],在许多人类肿瘤细胞系和原发肿瘤,如胰腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌等中均存在着STATs的异常表达和活性增强,其中以STAT3最突出。但在甲状腺癌中的研究尚未见到报导。本文构建STAT3-siRNA表达载体,并转染人甲状腺癌细胞株SW579,分析STAT3-siRNA表达载体沉默STAT3基因的效率以及对人甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 L-15培养基购自美国GIBCO公司产品;胎牛血清(FBS)为杭州四季青公司产品;RT-PCR AMV试剂盒为上海博日公司产品。兔抗人STAT3多克隆抗体及兔抗人β-Actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。
1.1.2 细胞株 人甲状腺癌细胞株SW579购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.2 试验方法
1.2.1 siRNA的合成和转染 合成STAT3 siRNA寡核苷酸,靶序列:5′-GCAGCAGCTGAACAACATG-3′ (2144-2162bp)。细胞同时用Scramble siRNA处理,靶序列:5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′,作为阴性对照,寡核苷酸均由上海吉马生物工程技术服务公司合成。细胞在没有抗生素的培养液中培养,在转染前24 h,细胞单层长至50%~70%,STAT3 siRNA 或Scramble siRNA 按照说明书与lipofectamineTM LTX混合,并加入细胞中,在37℃下转染6 h后,更换培养液,细胞再次培养于含100 ml/L的热灭活胎牛血清的L-15培养液中。
1.2.2 RT-PCR SW579细胞(5×10�5)接种于6孔板中,转染48 h后用Trizol试剂提取总RNA,用两步法RT-PCR试剂盒进行逆转录反应,反应体系中各加入两对引物,第1对为人STAT3基因引物,上游:5′-ATTCGGGAAGTATTGTCG-3′;下游:5′-GCCTCAGTCGTATCTTTC-3′。第2对引物为人β-actin基因引物,上游:5′-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3′;下游:5′-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3′。反应条件:94℃ 3 min,循环条件:94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 1 min,×30个循环;最后在72℃延伸10 min。RT-PCR产物在用EB染色的琼脂糖凝胶中观察。根据以下公式计算mRNA表达抑制率:抑制率(%)=1-(对照组平均相对灰度值/实验组平均相对灰度值)×100%。
1.2.3 Western blotting 检测SW579细胞(5×10�5) 接种于6孔板中,转染72 h后,收集细胞,并用冰PBS洗2遍,每孔细胞用lysis buffer 50 μl,等量蛋白(40 μg)在15 %SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离,并电转至销酸纤维素膜,然后用以TBS溶解的5 %的脱脂奶粉在室温封闭1 h,用兔抗人STAT3抗体(稀释至1�∶�500) 4℃孵育过夜,再用含0.1%吐温20的TBS洗液洗3遍,将膜与羊抗兔二抗孵育,以辣根过氧化物酶介导的化学发光法检测结果。同时膜还要与1�∶�1000稀释的抗β-actin 抗体孵育,最后用凝胶成像系统分析结果。根据以下公式计算蛋白表达抑制率:抑制率(%)=1-(对照组平均相对灰度值/实验组平均相对灰度值) ×100%。
1.2.4 MTT分析SW579细胞(5×10�5)被接种在96孔板中,总体系为0.1 ml,含有10 % L-15 培养液,24 h后细胞用siRNA处理,在培养24、48和72 h后加入MTT (每孔20 μl 溶解于PBS 浓度为5 mg/ml的MTT中),在37℃培养4 h后,加入100 μl DMSO终止反应。用酶标仪在490 nm测定吸光度A值定量反应产物。所有样本设6个复孔。根据以下公式计算细胞生长抑制率:抑制率(%)=1-(对照组平均A值/实验组平均A值)×100%。
1.2.5 RT-PCR 按1.2.2方法进行实验,MMP2上游引物:5′-ACCTGGATGCCGTCGTGGAC-3′;下游引物:5′-GTGGCAGCACCAGGGCAGC-3′。MMP9上游引物:5′-AGTTCCCGGAGTGAGTTGAA-3′;下游引物:5′-CTCCACTCCTCCCTTTCCTC-3′。反应条件:94℃ 3 min;循环条件:94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 1 min,×30个循环;最后在72℃延伸10 min。mRNA 表达抑制率计算方法同1.2.2。
1.2.6 Transwell侵袭小室实验 Transwell小室底部为8 μm孔径乙烯滤膜,预先铺上Matrigel凝胶(1 mg/ml)100 μl,将小室置于24孔板内,超净台内风干4 h。细胞转染后6 h,常规收集细胞,三组均以无血清L-15制成2×10�5/ml细胞液。各取100 μl移入小室。小室外加入各200 μl的条件培养和完全培养液。置37℃的培养箱内孵育72 h后取出。侵袭并黏附至下室面的细胞以10%甲醛固定,常规HE染色。在400倍高倍镜下细胞计数。细胞侵袭力抑制率(%)=(对照组下室面黏附的细胞数-实验组下室面黏附的细胞数)/对照组下室面黏附的细胞数×100%。
1.3 统计学方法 数据用均数±标准差(x±s)分析。所有统计分析用SPSS 17.0软件处理。以One-way ANOVA 法用于各组间比较,LSD法进行数据间的两两比较。P0.05)。转染STAT3 siRNA组STAT3 mRNA表达的抑制率为47.62%。Western blotting检测转染后72 h各组细胞STAT3蛋白表达变化,结果与STAT3 mRNA表达水平基本一致,经计算,转染STAT3 siRNA后蛋白表达抑制率为42.71%(图2)。
图1 RT-PCR分析STAT3 mRNA的表达
图2Western Blot检测STAT3蛋白表达
2.2 STAT3 siRNA对甲状腺癌细胞生长的影响 MTT法检测发现转染STAT3 siRNA 24、48和72 h后细胞生长明显受抑制,转染Scramble siRNA 对细胞生长影响不大。与Untreated组相比,转染24、48和72 h后,Scramble siRNA组细胞生长抑制率分别为3.36%、11.87%和7.91%,转染STAT3特异性siRNA组细胞生长抑制率分别为16.33%、61.46%和56.28%,在转染48和72 h后,转染STAT3特异性siRNA组生长抑制率显著高于Scramble siRNA组(P0.05)。转染STAT3 siRNA组MMP2和MMP9 mRNA表达的抑制率分别为17.99%及60.14%。Transwell小室实验检测转染后72 h各组细胞侵袭能力变化,结果与MMP2、MMP9 mRNA表达水平基本一致,经计算,转染STAT3 siRNA后细胞侵袭力抑制率为34.18%(图6)。
图4 RT-PCR分析MMP2 mRNA的表达
图5 RT-PCR分析MMP9 mRNA的表达
图6 Transwell侵袭小室实验直方图
3 讨论
甲状腺癌为常见的内分泌系统恶性肿瘤,颈部淋巴结转移率可高达50%～70%。虽然绝大多数分化型的甲状腺癌能通过手术、抑制TSH分泌和碘131治疗获得良好的治疗效果,但仍有1/3以上发生失分化,表现为转移灶摄碘能力降低或丧失,并且此类甲状腺癌细胞侵袭性增强,转移速度快,是影响预后的一个重要原因[2,3]。由于失分化和低分化甲状腺癌的摄碘能力的丧失,不能接受常规的联合治疗。因此,很多学者认为其进一步解决可能依赖于新兴的生物治疗[4]。RNA干扰(RNA interference,RNAi)近年来发展迅速,广泛应用于基因功能分析的研究领域,并且逐步成为对病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等进行基因治疗研究的一种手段[5]。RNAi技术具有其他基因敲除手段所无法比拟的特征:高度的序列特异性、抑制基因表达的高效性、RNAi的放大效应以及维持效应的长久性等。RNAi作为一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段,有助于研究基因在生物模型系统中的作用,是进行基因功能研究的重要工具,并且有望成为基因治疗的新方法。目前RNAi技术已广泛应用于恶性肿瘤等疾病的研究,但是在甲状腺癌的研究中还未见报道。
STAT3是信号转导子与转录激活子家族(STATs)的重要成员,是EGFR,IL-6/JAK,Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号汇聚的焦点,直接影响细胞的增殖、分化及凋亡过程[1,6]。研究发现,其过度激活及表达可导致细胞的无限生长,抵抗凋亡,发生癌变[7-9]。因此,STAT3被称为转录因子类癌基因。过度激活的STAT3生成同源二聚体,移入细胞核,识别并结合到靶基因DNA特异的反应元件,调节细胞周期控制基因c-Myc,cyclins D1以及MMP2、MMP9等基因的表达[10-13],从而打开了有利于肿瘤细胞生长存活的信号传导网络。这使得STAT3途径成为抗肿瘤治疗研究的理想靶位。我们在前期的研究中发现,STAT3在甲状腺癌的组织中高表达,在正常甲状腺组织中不表达。因此猜测STAT3参与了甲状腺癌发生与发展的过程,理论上阻断肿瘤细胞癌基因STAT3信号传导通路就有可能起到治疗肿瘤的作用。
本实验中我们应用RNAi技术,采用重组载体法,首先从NCBI上获得靶基因STAT3的mRNA的全序列,并利用siRNA设计软件,设计并合成针对STAT3的siRNA序列。然后将其与pGPU6/GFP/Neo真核细胞表达载体连接,构建RNAi重组体,再将其转染到人甲状腺癌细胞系SW579中,进而抑制细胞中STAT3基因的表达,来研究STAT3基因沉默后细胞功能的变化。应用Western印迹方法和RT-PCR反应检测STAT3基因沉默效率,结果显示STAT3-siRNA组细胞的STAT3基因的蛋白和mRNA表达较Untreated组和Scramble siRNA组的SiRNA细胞均有明显的降低,差异具有统计学意义(P [7] Bromberg J. Stat proteins and oncogenesis. J Clin Invest,2002,109(9):1139-1142.
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