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摘 要：目的：研究复方虫草制剂-天力克注射液对人肝癌细胞HepG-2抗肿瘤作用的分子机制及其对端粒酶活性的影响。方法：用透射电镜观察超微结构的变化；Hoechst33258荧光染色观察细胞核形态的变化；应用流式细胞仪(FCM)PI染色检测细胞周期变化及bcl-2的变化，AV/PI双染检测细胞膜的改变；免疫组化方法测定Survivin蛋白及NF-κBp65的表达；用TRAP-PCR-银染法对肝癌细胞端粒酶活性进行检测。结果：Hoechst33258荧光染色显示天力克使细胞核轻微浓缩；免疫组化显示天力克使Survivin蛋白及NF-κBp65的表达下调(P0/G1期及G2/M期细胞比例下降(P[1]。本试验旨在研究复方虫草制剂-天力克注射液对人肝癌细胞的作用机制。
1 材料和方法
1.1 试剂与方法
人肝癌细胞株HepG-2为兰大基础医学院病理实验室保存；天力克原液(批号：200212292)由甘肃东佳源研究所提供；5-氟尿嘧啶(南通精华制药有限公司，批号：050308)；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司，型号为SW-CJ-2FD。CO�2孵箱：日本SANYO；荧光电动倒置显微镜：OlympusIX81；透射电镜JEOL-1230；流式细胞仪：CoulTER Epics XL；PCR仪：MJ PTC-220。
1.2 方法与分组
1.2.1 分组
细胞形态、细胞周期及端粒酶的测定分天力克注射液组，5-氟尿嘧啶组(南通精华制药有限公司，批号：050308)及阴性对照组；免疫组化分为天力克注射液组，5-氟尿嘧啶组，阴性对照组和阳性对照组。
1.2.2 细胞培养及细胞形态变化的观察
将冻存的肝癌细胞株HepG-2从-196℃液氮罐取出，细胞常规复苏及传代[2]。取对数生长期HepG-2细胞进行相关实验。透射电镜观察细胞超微结构，依据文献[2]，取对数生长期细胞，用天力克注射液稀释10倍作用48h，对照组不加药物，5-氟尿嘧啶组调整终浓度为250μg/mL作用48h后。透射电镜观察结果并拍照。荧光显微镜观察细胞核变化，用碧云天生物科技有限公司Hoechst 33258染色试剂盒，按说明书操作，置荧光显微镜下观察，可检测到呈蓝色的浓缩细胞核。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期、细胞膜改变及bcl-2的变化
用含10%胎牛血清的1640完全培养液培养至对数生长期，用终浓度为稀释10倍的天力克注射液作用于肝癌细胞，阴性对照组不加药物，5-氟尿嘧啶组调整终浓度为250μg/mL，继续培养48h，固定后分3份。一组加入RNaseA(终浓度为20mg/L)及PI染液(终浓度50mg/L)，摇匀后室温避光静置1h，经尼龙网过滤，置Coulter EpicsXL型流式细胞仪计数，测定细胞周期中不同时相的细胞数及各期细胞DNA含量并计算凋亡细胞所占比例；另一份按说明书，加100μl A液(破膜液)，室温孵育15min，离心(1000rpm)5min，弃取上清液，用PBS液洗涤，离心(1000rpm)5min，弃取上清液，加入B液(固定液)，同时加入bcl-2-FITC荧光染料，室温孵育15min，离心(1000rpm)5min，弃取上清液，加入400μlPBS液，上流式细胞仪检测bcl-2变化；另外一份离心沉淀(1000rps)5min，PBS清洗2次，将细胞悬浮于200μl结合缓冲液，加入10μlAnnexin-V-FITC(20μg/ml)避光室温反应15min，再加入5μlPI(50μg/mL)染色5min，加入300μl结合缓冲液，立即置Coulter EpicsXL型流式细胞仪检测，获得由四个象限组成的细胞直方图(cytogram)，每个象限的细胞数目就是在检测细胞总数所在点的组分。左下象限代表正常细胞(An-PI-)，右下象限代表早期凋亡细胞(An+PI-)，右上象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞(An+PI+)，左上象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)。
1.2.4 免疫组化法测定Survivin蛋白及NF-κBp65的表达
依据文献[2]，采用酶标记的链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(简称SP法)，(一抗系SANTA公司产品，免疫组化试剂盒系北京中山金桥公司产品)检测天力克对HepG-2细胞的NF-κBp65及Survivin蛋白的影响。结果判断以细胞质出现棕褐色颗粒为Survivin蛋白阳性染色，NF-κBp65抗体染色阳性细胞为单纯胞核出现棕褐色颗粒或胞核和胞质着色以胞核着色为主。每张图片于高倍视野下随机计数10个视野，计算阳性的细胞数占细胞总数的百分率。
1.2.5 端粒酶活性检测采用TRAP-银染法
用凯基TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒，操作按试剂盒说明书进行。行细胞端粒酶的提取，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，点样后电压改为150mv，电泳1h，银染。结果判定：端粒酶的阳性产物为相隔6个pb条带，最小的条带为40pb。在白光灯箱上用透射照明法对凝胶进行摄影，用电泳分析软件进行分析。
1.3 统计方法
实验数据采用SPSS 10.0统计软件，单因素方差分析法及卡方检验进行统计学分析，单因素方差分析以均值±标准差表示，P0/G1期细胞比例下降，S期比例明显增高，G2/M期基本消失，与对照组比较差异有显著性(�CP
图2-1 式细胞仪AV/PI染色 天力克作用48h后HepG-2早期凋亡变化
2.3 天力克对HepG-2细胞形态的影响
Hoechst 33258荧光染色检测时，在荧光显微镜下可观察到正常细胞核发蓝色荧光，染色质均匀分布，天力克注射液作用48h后细胞核可见轻度浓缩改变；用5-氟尿嘧啶干预后，细胞核体积变小，染色质致密浓染，或呈颗粒状块或月牙形致密浓染，呈现细胞凋亡改变(见附图3-1、3-2)。
图3-1 荧光显微镜 天力克作用HepG-2细胞48h细胞形态变化×400
图3-2 荧光显微镜HepG-2细胞对照组×400
透射电镜下未用药组细胞膜完整，胞核和细胞器结构清晰；用5-氟尿嘧啶干预后，胞核固缩，核染色质浓缩至核膜下呈新月状或块状；天力克原液作用48h后，细胞质出现大量空泡，细胞核核浆比例减小(见图4-1、4-2)。
图4-1 透射电镜 HepG-2细胞形态对照组×8000
图4-2 透射电镜 天力克作用HepG-2细胞48h6细胞形态变化×6000
2.4 天力克对肝癌HepG-2细胞NF-κBp65及Survivin
蛋白的影响
天力克作用肝癌HepG-2细胞48h时，免疫组化染色示NF-κBp65表达下调，与阳性对照组比较差异有显著性，与5-氟尿嘧啶组比较无显著性差异；Survivin蛋白的表达下调，与阳性对照组比较有显著性差异(P0.01)(见表4，附图6-1)。
图6-1 流式细胞仪 天力克作用HepG-2细胞48h bcl-2 蛋白表达
2.6 天力克注射液对HepG-2肝癌细胞端粒酶活性的
影响 对照组HepG-2肝癌细胞系的端粒酶活性较高，电泳图像分析系统半定量分析，单因素方差分析显示天力克组与5-氟尿嘧啶组、对照组比较差异有显著性(P[3]。
凋亡：I型程序性死亡，早期细胞支架塌陷而细胞小器官一直存在；自噬：II型细胞程序性死亡，早期细胞小器官降解而细胞支架成分保存。凋亡是以Caspase依赖和核内DNA裂解为特征；而Caspase激活和DNA裂解在自噬细胞死亡过程中发生得非常晚。与坏死比较，凋亡和自噬细胞死亡都以缺乏组织炎症反应为特征[4]。Sophie Pattingre 等[5]实验表明，恶性细胞往往表现出比正常细胞低的自噬活性，且在血清减少或细胞浓度增高时自噬活性仍较低。另有发现，自噬执行蛋白Beclin-1是肿瘤抑制蛋白，原癌基因信号分子(I型磷酸肌醇-3-激酶，Akt，mTOR)抑制自噬，且肿瘤抑制物(PTE-N，p53，DAPk)刺激自噬。而且，一些化疗药物(rapamycin and tamoxifen)是强力自噬诱导剂。自噬作用在肿瘤抑制中可能的机制包括：特异性的细胞小器官和调节细胞生长的长寿蛋白的降解；清除产生活性氧和增加基因毒性的已损坏的细胞器官及非凋亡形式的程序性细胞死亡――自噬性细胞死亡的诱导。体内外实验证实Bcl-2通过结合beclin-1抑制Beclin 1-介导的自噬细胞死亡，下调饥饿诱导的自噬及细胞自噬水平。但有研究表明，细胞自噬是在营养缺乏状态下，细胞通过自噬生成核酸、氨基酸及游离脂肪酸等小分子物质，再循环合成ATP及其他大分子物质，促进细胞增值，如果持续饥饿，细胞会产生II型程序性死亡[5]。本实验显示天力克作用于HepG-2细胞时，形态学检测出现自噬改变，而5-氟尿嘧啶组出现细胞凋亡改变。
天力克注射液是甘肃东佳源医药科研所选用野生黑蚂蚁、沙棘、元胡、�术、地龙、冬虫夏草几种中草药，运用高科技手段，精制提炼成可以静脉输注的复方中药注射液。具有止痛、调节免疫及抗肿瘤作用。本实验研究表明，天力克可使肝癌HepG-2细胞膜发生改变，AV/PI染色显示磷脂酰丝氨酸外翻，细胞质空泡变性，胞浆内容物降解，荧光染色显示胞核轻微浓缩，胞核染色均匀，细胞出现自噬表现；使抑制凋亡基因因子Bcl-2及Survivin蛋白表达下调，并引起端粒酶的活性下调，推测其端粒酶活性下调由Bcl-2及Survivin蛋白表达下调引起，而bcl-2表达的下调与NF-κB表达下降有关，bcl-2表达的下调促进细胞自噬。
参考文献：
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(责任编辑：陈涌涛)
