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【摘要】 目的 探讨脂肪组织中是否存在缺氧预适应现象，构建CoCl2致缺氧的缺氧模型。方法 不同浓度的CoCl2大鼠腹股沟区皮下层浸润注射，分别用免疫组织化学法和RT-PCR法检测该区脂肪HIF-1α蛋白和HIF-1α mRNA的表达情况。结果 用不同浓度的CoCl2行化学缺氧后在不同时间点观察有不同程度的HIF-1α蛋白和HIF-1α mRNA表达，其中，在浓度为20～40 mg/kg，时间为3 h时脂肪组织中HIF-1α表达达高峰。结论 脂肪组织存在缺氧预适应现象；CoCl2的浓度选择20～40 mg/kg，时间选择3 h时缺氧预适应效果较佳。
【关键词】脂肪移植；缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)；二氯化钴(CoCl2)；缺氧预适应
Study on the express of HIF-1α protein and HIF-1α mRNA afterin jected CoCl2
LIANG Jie, PENG Jun-qiang, PENG Zhi,et al.Department of plastic Beauty, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China
【Abstract】 Objective To investigate whether hypoxia preconditioning exist in adipose tissue,and construct the hypoxemic model of adipose tissue.Methods After injected different density CoCl2 to rat’s subcutaneously of groin,use immunohistochemical method detect HIF-1α protein，and use RT-PCR detect HIF-1α mRNA.Results After injected different density CoCl2,the adipose tissue of rat’s groin express different degree of HIF-1αprotein and HIF-1αmRNA.,and reach the peak when the density is 20-40 mg/kg and the time is 3 h.Conclusion Hypoxia preconditioning exist in adipose tissue,and the effect of preconditioning is most evidence when the density is 20-40 mg/kg and the time is 3 h.
【Key words】Fat transplantation；Hypoxia-inducible factor 1 α(HIF-1α)；CoCl2；Ischemic preconditioning (IP)
自体脂肪组织作为理想的软组织填充材料，具有生物相容性好，且没有免疫排斥反应，来源丰富等优点。但研究发现移植的脂肪颗粒，在体积和质量上减少30%~60%，甚至更多，且坏死的脂肪颗粒会引起纤维囊性化和假性囊肿[1]。目前提高脂肪组织游离移植成活率的研究主要集中于促进移植体血管生成，但不能在脂肪移植体血供恢复之前减少脂肪组织的坏死和纤维囊性化。80年代组织学的研究表明，在脂肪游离移植后10~20 d才有真正意义上的血管生成，此10~20 d为移植脂肪存活的窗口期[1,2]。提高脂肪组织在窗口期对缺血缺氧的耐受力是移植脂肪存活的关键。研究表明缺氧预适应可以提高多种组织对缺血缺氧的耐受力。
1 材料和方法
1．1 动物及分组 清洁级雌性SD大鼠72只，月龄2个月，体质量(20±20)g(由广东医学院实验动物中心提供)；按随机数字表法分成9组； 按量效关系分5组，分别对应0 mg/kg组、 5 mg/kg组、 10 mg/kg组、20 mg/kg组、40 mg/kg组；按时效关系分5组，分别对应 1 h组、3 h组、6 h组、12 h组、24 h组。其中量效关系20 mg/kg组与时效关系6 h组重合。
1．2 缺氧模型的构建 碘伏消毒后沿右侧腹股沟从内下到外上在皮下层作均匀的局部浸润注射CoCl2，注射后行轻柔按摩。按设计在注射后一定的时间切取右侧腹股沟区脂肪，取下脂肪约3～4 ml。
1．3 指标检测 免疫组织化学法(SABC法)检测HIF-1α蛋白表达情况,40倍物镜下取相互不重叠的4个视野，应用显微图像分析仪，测定HIF-1α蛋白阳性反应物的平均面密度值；RT-PCR法检测HIF-1αmRNA的表达情况，扩增HIF-a基因的上游引物的序列为：5’-AAGTCTAGGGATGCAGCA-3’，下游引物的序列为：5’-CAAGATCACCAGCATCATG-3’(175 bp)。PCR反应条件为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火45 s，循环30次后72℃延伸10 min。
1．4 统计学处理 数据采用SPSS11．5 for windows统计软件包处理，所得数据以均数±标准差(x±s)表示，各组均数的比较采用方差分析，组间比较用SNK法，P0．05)，20 mg/kg组、40 mg/kg组与0 mg/kg组比较差异有统计学意义(P0．05)。
2．2 时间组 20 mg/kg浓度 CoCl2行化学缺氧后1、3、6、12、24 h均有HIF-1α阳性细胞表达。SNK组间比较显示：3 h组表达达高峰，12 h组、24 h组均下降。3 h组、6 h组和1 h组比较差异有统计学意义(P0．05)，见表2。
3 讨论
用不同浓度CoCl2于大鼠腹股沟区皮下层作局部浸润注射行化学缺氧后该区脂肪组织在不同时间有不同程度HIF-1α的表达。HIF-1α是氧调节蛋白，为HIF-1独有的亚基，它的表达决定HIF-1的表达。由HIF-1所诱导的各种基因及其产物或能增加缺氧组织的氧供和运输能力,或能降低细胞耗氧量,从而缓解氧供求之间的矛盾,以维持内环境的稳定,使机体对缺氧产生耐受与适应[3]，如HO-1、NOSs、VEGF、EPO等。HIF-1α是组织缺氧预适应中最关键的产物。它的表达说明脂肪组织存在缺氧预适应，但它对提高脂肪组织游离移植成活率的作用还有待进一步研究。
有关提高脂肪组织游离移植成活率的研究，目前主要集中在促进脂肪移植体血管的生长方面。应用多种促血管生长因子、细胞，或结合多种载体进行缓释。如刘宇兰等[4]用携带 VEGF的裸质粒直接在移植脂肪内注射；Yuksel等[5]将胰岛(Insulin)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、bFGF及其混合物引入生物可降解的聚乳酸-乙醇酸共聚物/聚乙二醇 (PLGA/PEG)微囊中，制成缓释剂，混合在脂肪中进行移植。杜学亮等[6]在颗粒脂肪移植的实验动物模型中应用以多聚糖酐珠为bFGF的载体；易成刚等[7]体外分离、培养人脐血中 EPCs，利用脂质体介导VEGF165基因转染到EPCs组中，EPCs整合到缺血部位新生血管中其脂肪存活率均显著高于对照组；VEGF165基因转染组与EPCs组脂肪组织周边区毛细血管密度差异有统计学意义，均高于对照组。而转染 VEGF165基因的EPCs具有更强的促血管新生的作用。这些研究的结果表明能提高脂肪游离移植体的成活率，但不能避免脂肪组织在血供未完全恢复时发生坏死。组织学的研究表明，在脂肪游离移植后10～20 d才有真正意义上的血管生成，此10～20 d为移植脂肪存活的窗口期。提高脂肪组织在窗口期对缺血缺氧的耐受力是移植脂肪存活的关键 [1，2]。研究表明缺氧预适应可以提高多种组织对缺血缺氧的耐受力。缺血缺氧预适应是给予机体1次或多次亚致死性的缺血缺氧性刺激，能使机体对随后的更强刺激产生适应或减轻其反应强度。Murry等[8] (1986年)首次用实验证明了这一现象的存在：如果患者至少有1次的前期心绞痛事件，在随后发生的长时间的缺血中，由缺血导致的损伤会减轻,并命名为“缺血预适应”(IPC)。随后越来越多的对各种动物和组织(包括骨骼肌、脊髓、肺、肝脏、肾脏、胃、小肠、脑以及内皮细胞)的研究显示[9，10]短期的缺血和缺氧能使组织从随后的较长时间的缺血中存活下来。缺氧状态诱导一系列特异性的与血管新生、能量代谢等密切相关的基因的表达，帮助自身调节和适应低氧微环境，在此过程中起关键作用的是HIF-1，它广泛参与各动物细胞中。
本组实验结果显示，用不同浓度CoCl2于大鼠腹股沟区皮下层作局部浸润注射行化学缺氧后该区脂肪组织在不同时间有不同程度HIF-1α的表达。其中，浓度组中20 mg/kg组和40 mg/kg组HIF-1α的表达最显著，时间中于3 h组达最高。说明脂肪组织存在缺氧预适应现象。对其他组织的研究表明，缺氧预适应通过促进HIF-1等缺氧耐受基因的表达从而提高组织对缺血缺氧的耐受能力，提高组织在缺血缺氧状态下存活能力。脂肪组织的缺氧预适应可以增强脂肪移植体在移植后10～20 d未有血管生成的窗口期对缺血缺氧的耐受能力，提高脂肪游离移植的存活率，但它作用的大小还需进一步研究。
参考文献
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