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[摘要] 目的:探讨局部应用肝素在外伤性鼓膜穿孔愈合中对转化生长因子-α(TGF-α)的影响。方法:建立大鼠鼓膜穿孔模型50只,将其随机分成两组,分别用肝素明胶海绵、表皮生长因子(epidermial grouth factor,EGF)明胶海绵黏补,空白对照,观察不同时间点不同组鼓膜愈合情况并取其标本进行免疫组织化学染色,测其转化生长因子-α(TGF-α)的表达水平。结果:肝素组与空白组TGF-α表达有差异(P0.05)。结论:局部应用肝素能促进转化生长因子-α(TGF-α)在鼓膜各层的表达,并延长其表达时间。
[关键词] 肝素;鼓膜穿孔;表皮生长因子;转化生长因子-α
[中图分类号] R764.8 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2010)06(a)-016-02
The effect of heparin on the TGF-α during the traumatic tympanic membrane perforation in animal models
MIAO Xiaoming,JI Yongjin,LI Qingfeng,GAO Zhujuan,MA Min*
(Department of Otorhinolaryngolog, the Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Province, Taiyuan 030001, China)
[Abstract] Objective: To approach the efficacy of local application heparin on the TGF-α during the treatment of acute traumatic tympanic membrane perforation (TMP) in the animal models. Methods: Developed an animal model of traumatic TMP in the rat and 50 wistar rats were used.They were randomly divided into two groups and treated by heparin combined with gelfoam pledget, EGF combined with gelfoam pledget which was placed over the TMP and blank control separately,then observe the state of the TMP and examined by immunohistochemical method using polyclonal expression level of TGF-α. Results: Statistical difference between treated and control ears in the expression of TGF-α was evident(P0.05). Conclusion: Local application heparin can accelerate the expression of healing of TGF-α in acute traumatic TMP in the animal models.
[Key words] Heparin; Hympanic membrane perforation; Epidermal growth factor; Transforming growth factor-α
鼓膜穿孔愈合过程需要多种细胞因子的参与,如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)等。研究发现在创伤愈合的过程中上述生长因子都以与肝素结合的形式存在,不仅可以提高生长因子的生物学效应,而且可以保护其免于被各种理化因素灭活[1-2]。肝素有利于创伤修复已被国内外学者所证实[3-4],表皮生长因子在鼓膜穿孔愈合中的作用也已经被证实[5],肝素在鼓膜穿孔中对转化生长因子-α(TGF-α)的影响至今未见报道。探讨在外伤性鼓膜穿孔愈合过程中肝素对转化生长因子-α(TGF-α)的影响是本研究的重点。
1 资料与方法
1.1 一般资料
Wistar大鼠50只(山西医科大学生理教研室动物中心提供),肝素钠(江苏常州千红生化制药有限公司(12 500 U,2 ml),重组人表皮生长因子(深圳市华生元基因工程发展有限公司,2 000 IU/ml,5ml),兔抗鼠转化生长因子-α(TGF-α),二步法免疫组化检测试剂盒PV6001(武汉博士德)。
1.2 方法
1.2.1 鼓膜穿孔模型的建立选择健康Wistar大鼠50只,体重200～250 g,雌雄不限,耳廓、外耳道及鼓膜正常。用75%酒精消毒外耳道,参照Amoils CP[6]介绍的方法,用热灼针尖在双耳鼓膜紧张部制成面积约2 mm×2 mm的圆形穿孔,24 h后观察鼓膜情况,造模成功者即对穿孔进行黏补治疗。术后用氨苄青霉素(150 mg/kg)肌内注射,预防感染,每天1次,连续5 d。
1.2.2 试验分组及处理50只Wistar大鼠造模成功后分为两组:第一组25只,其左外耳道置无菌干棉球,预防感染,右耳行肝素明胶海绵黏补;第二组25只,其左耳用EGF明胶海绵黏补,右耳行肝素明胶海绵黏补。每天在电耳镜下观察鼓膜愈合情况,并分别于术后1、3、5、7、10 d时,每组选取5只大鼠,取出明胶海绵观察鼓膜愈合情况,然后以10%的甲醛溶液灌入外耳道,处死大鼠,解剖颞骨,剥离听泡外侧壁,将其置于10%甲醛溶液中固定24 h,将鼓膜自听泡外侧壁中鼓环上完整剥离。对取得的鼓膜标本(每个时间点10个鼓膜)用10%甲醛固定,酒精梯度脱水,常规石蜡包埋、切片,再按TGF-α的检测试剂盒要求处理,进行常规免疫组化染色。采用BI-2000医学图像分析系统对染色结果进行定量分析,测定其灰度值,以反映双耳不同时间TGF-α的表达水平。
1.3 统计学分析
对上述两组所测数据进行统计学分析,各组标本之间差异性检验采用配对样本(同体比较)的t检验,以P0.05)。TGF-α、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的表达,在3 d时均达到最高峰,以后逐渐减少。肝素组10 d时的表达水平高于空白组3 d时的表达水平。见表1、2。
3 讨论
鼓膜穿孔愈合过程需要多种细胞因子的参与,如表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)等。肝素是糖氨基多糖族中的一种碳水化合物。它主要从猪肠黏膜或牛肺组织中提取,药用肝素经肝素酶降解后分子量为3 000～30 000。肝素问世已有80余年, 近年来其许多生物学活性被逐渐发现,除抗凝作用外,还发现其有抗感染、免疫调节、促进创面愈合的作用。研究发现,在创伤愈合中TGF-α、bFGF和EGF等都以与肝素结合的形式存在,并以此形式与受体结合产生生物学效应,不仅可提高其生物学效应,还可以保护其免于被各种理化因素灭活[1-2]。本研究通过肝素明胶海绵黏补治疗外伤性鼓膜穿孔,测定不同处理组不同时间段TGF-α的表达水平,证实肝素可增加TGF-α的表达水平并延长其表达时间,进而促进外伤性鼓膜穿孔的愈合。免疫组化结果显示空白组只有鳞状上皮层有生长因子的表达,而肝素组三层均有表达。肝素组TGF-α在1、3、5、7、10 d时的表达均明显多于空白组,而与EGF组的表达差别不大,说明肝素能促进生长因子的表达,10 d时肝素组TGF-α、bFGF的表达水平甚至高于空白组高峰期即第3天时的表达水平,说明肝素能延长生长因子的表达时间。生长因子在鼓膜穿孔愈合中起重要作用,肝素通过调控生长因子TGF-α的表达促进外伤性鼓膜穿孔的愈合,为肝素明胶海绵黏补法治疗外伤性鼓膜穿孔提供了理论依据。
[参考文献]
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(收稿日期:2010-04-13)
