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【关键词】 慢性乙型肝炎；实时荧光PCR；YMDD变异 拉米夫啶是常用的核苷类抗乙型肝炎病毒（HBV）药物，对HBV有明显的抑制作用，但随着拉米夫啶的广泛应用，许多文献报道已证明YMDD变异是引起拉米夫啶耐药的机制，为了解慢性乙型肝炎患者YMDD变异的存在状况，对262例慢性乙型肝炎患者进行了HBV DNA YMDD变异的检测，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 一般材料 262例血清样本均来自中山大学附属第二医院2009年9月至2010年6月收治的慢性乙型肝炎患者，全部病例符合2000年9月西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中慢性乙型肝炎的诊断标准。
1.2 仪器与试剂 ABI 7500荧光定量PCR仪，来自美国应用生物系统公司；乙型肝炎病毒核酸扩增（PCR）荧光定量测定及YMDD变异检测试剂盒，来自艾康生物技术（杭州）有限公司。
1.3 标本采集 用一次性注射器抽取患者静脉血1～2 ml，置于灭菌的一次性试管中（不可用肝素抗凝），3000～4000 rpm离心20 min，分离血清，－20℃保存不超过7天。
1.4 检测方法 采用乙型肝炎特异引物及特异Taqman MGB探针，并结合FQ-PCR技术，同时检测HBV载量以及YMDD变异情况。取待测血清样本、强阳性、临界阳性、阴性血清对照品各50 ul于1.5 ml灭菌离心管中，分别加入50 ul核酸提取液，混匀后2000rpm离心10sec，100℃水浴10 min,12000 rpm离心10 min；按试剂盒要求配置反应混合液并进行操作，每个测试样本平行用A、B、C反应混合液来检测，选择37℃ 2 min,95℃ 5 min，再按94℃ 20sec→62℃ 60sec循环40次进行PCR扩增反应。在62℃采集FAM荧光信号。
1.5 结果判断 基线调整取2～15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，检测符合质控标准。根据HBV反应混合液A的结果进行HBV DNA定量。YMDD变异分析：样品反应混合液B检测阴性，反应混合液C检测阳性，判该样品为YIDD变异株；样品反应混合液B检测阳性，反应混合液C检测阴性，判该样品为YVDD变异株；样品反应混合液B检测阴性，反应混合液C检测阴性，判该样品为野生型株；样品反应混合液B检测阳性，反应混合液C检测阳性，判该样品为YVDD/YIDD共生株。
2 结果
2.1 262例慢性乙型肝炎患者血清样本中共检测到YMDD突变株15例，占5.7%（15/262），其中YVDD变异11例，占4.2%（11／262），YIDD变异3例，占1.1%（3/262），YVDD/YIDD变异1例，占0.4%（1/262）。
2.2 血清HBV DNA定量水平与YMDD变异类型的关系见表1。
表1 血清HBV DNA定量水平与YMDD变异类型的关系
3 讨论
YMDD是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸这4个氨基酸的缩写，该4个氨基酸位于HBV DNA聚合酶上，是拉米夫啶的主要作用位点，如果该位点发生突变就称为YMDD变异。最常见的变异是M（蛋氨酸）被V（缬氨酸）或I（异亮氨酸）取代，分别称为YVDD或YIDD变异。一些学者研究［1］显示，不是所有的YMDD变异与药物作用有关，YMDD变异株可在拉米夫啶治疗过程中出现，也可天然存在。本组资料显示在慢性乙型肝炎患者中YMDD变异占5.7%，其中以YVDD变异
作者单位：671000 云南省大理州人民医院检验科（杨红樱）；广东省中山大学附属第二医院检验科（王敏 庄豪）
最为多见，其次为YIDD变异及YVDD/YIDD变异。YMDD变异可发生于HBV DNA 病毒载量的不同水平，但HBV DNA病毒载量在1.0×10^5-1.0×10^6、1.0×10^7-1.0×10^8时YMDD变异共11例，占总变异株的73.3%（11/15），说明YMDD变异株HBV DNA复制时处于中、高度水平。因此通过对乙型肝炎患者的YMDD动态检测来进行合理的用药，让HBV DNA持续转阴或保持在一个很低的水平，防止肝病进展具有重要的临床实用价值。
参考文献
［1］ 王迎秋，普冬，HBV YMDD自然变异的临床分析.中国热带医学，2009，9（4）：652-653.
