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【摘要】 目的 优选金樱叶总黄酮的提取工艺,为金樱叶进一步的研究打下一定的基础。方法 采用L�9 (3�4)正交试验,以金樱叶总黄酮的含量为综合指标考察乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和超声功率4个因素对提取效果的影响。结果 最佳提取工艺为40倍量50%的乙醇,28KHz、90W超声60 min,总黄酮得率为11.64%, RSD%为1.97%。结论 该工艺合理,稳定可行,可为金樱叶总黄酮提取工艺的确定提供实验依据。�
【关键词】 正交试验;金樱叶;总黄酮;提取工艺��
OptimumExtracting Tcchnology for Total Flavonoidsfrom Cherokee Rose’s Leaves by Orthogonal Test CHEN Ying-wen,CHEN Mu-shui.First hospital affilated to Guangzhou medical university.Guangzhou 510000,China
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【Abstract】 Objective To optimize the extraction technology for total flavonoids from Cherokee Rose’s Leaves, and give reference for development and utilization of total ftavonoids.Methods The process was studied by orthogonal design L�9 (3�4) with the extraction rate of total flavonoids and paste- forming rate as comprehensive indexand researched the effect of alcohol amountalcohol dcnsity,extraction duration and the extraction frequency on extraction rate.Results The optimum process as followsthe crude drug was extracted by the 50% alcohol density40 times alcohol and 28KHz for 60 min. Conclusion This technology is rcasonable and feasible,which can be used as experimental basis for extraction technology for total ftavonoids.�
【Key words】 orthogonal test, Cherokee Rose’s Leaves,total flavonoids,extraction technology
金樱叶为蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx的嫩叶,味辣,性平。清热解毒、活血止血、止带、主痈肿疔疮、烫伤、痢疾、闭经、崩漏、带下、创伤出血[1]。金樱叶中含有多种有效成分,黄酮类如原矢车菊素(procyanidin)B-3、芹菜素等;鞣质类如蛇含鞣质(potentillin)、金樱子鞣质(laevigatin)C等。其中黄酮类成分具有体外抗肿瘤作用[2,3],因此本实验采用4因素3水平等正交试验L�9(3�4),选择总黄酮含量为综合考查指标,优化金樱叶的提取工艺,为开发新的抗癌药物提供理论参考。�
1 仪器与试药�
1.1 仪器 超声仪:KQ-3200VDB型双频数控超声波清洗器(昆山市舒美),紫外分光光度计:UV-1102紫外/可见分光光度计(上海天美);分析天平:SH 200E型电子天平,粉碎机:DFY-400,400 g摇摆式高速中药粉碎机(温岭市林大机械)。�
1.2 试药
材料:金樱叶来源于蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx的嫩叶,本实验采摘自中山市。试剂:芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇为分析纯。�
2 方法与结果�
2.1 因素及水平考察 为系统考察乙醇超声提取金樱叶总黄酮的工艺参数,根据文献资料及实际情况选择乙醇浓度、超声时间、固液比和超声功率作为考察因素,以测得样品中总黄酮含量为考察指标,选用L�9 (3�4) 正交表实验,选出因素水平(见表1)。�
2.2 金樱叶的预处理 将采摘的金樱叶去除大部分枝梗,取叶片,晾干后用粉碎机粉碎成细粉,备用。称取一定量的金樱叶粉末,以1:8~1:10的固液比加入60℃~90℃的石油醚,超声40 min后取出,弃去石油醚液,继续加入新的石油醚溶剂,再超声40 min,重复以上操作3~4次后,过滤,弃去石油醚液,挥干溶剂,烘干后成脱脂金樱叶粉末,备用。�
2.3 供试品溶液的制备 精密称取约0.5 g的脱脂金樱叶粉末,置100 ml的锥形瓶中,以一定的固液比加入一定浓度的乙醇溶液,在一定的超声功率下超声一定时间,取出,过滤,滤液用所提取的乙醇定容到50 ml容量瓶中,作为供试品溶液。�
2.4 金樱叶总黄酮的测定�
2.4.1 标准溶液的制备 精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁25 mg对照品置25 ml容量瓶中,加80%乙醇适量,置水浴上微热,溶解,放冷,加乙醇稀释至刻度,摇匀,精密量取10 ml,置100 ml容量瓶中,加80%乙醇至刻度,摇匀,即得(含无水芦丁 0.1 mg/ml)。�
2.4.2 测定波长的选择 取供试品溶液1 ml置50 ml的容量瓶中,加入5%的亚硝酸钠溶液1 ml, 摇匀,6 min后,加入10%的硝酸铝溶液1 ml,摇匀,6 min后,再加入4%的氢氧化钠溶液10 ml,加水稀释至刻度,摇匀后,静置15 min。置紫外分光光度计UV-1102进行全波长扫描,得出在509.5nm处有特征吸收峰,吸光度值为0.246,因此,将509.5 nm定为最大吸收波长。�
2.4.3 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 ml分别置于标号为0、1、2、3、4、5、6、7、8的10 ml容量瓶中,各加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml, 摇匀,6 min后,加入10%硝酸铝溶液0.3 ml,摇匀,6 min后,再加入4%氢氧化钠溶液4 ml,加水稀释至刻度,摇匀后,静置15 min。以试剂为空白参比液,将所有的待测溶液置紫外分光光度计UV-1102在509.5nm处测得吸光度值,以芦丁浓度(C)作为横坐标,以吸光度值(A)作为纵坐标,作图,回归处理后得一标准曲线方程为:A=10.724C-0.0088,R2=0.9991,线性相关性良好。�
2.4.4 精密度试验 取供试品6份,测量吸光度分别为0.315,0.315,0.314,0.314,0.315,0.315,相对标准偏差(RSD)为0.17%,表明仪器精密度良好。�
2.4.5 稳定性试验 取适宜浓度的芦丁标准品溶液5.0 ml置50 ml容量瓶中,加入5%的亚硝酸钠溶液1 ml, 摇匀,6 min后,加入10%的硝酸铝溶液1 ml,摇匀,6 min后,再加入4%的氢氧化钠溶液10 ml,加水稀释至刻度,摇匀后,静置15 min。以试剂为空白参比液,置紫外分光光度计UV-1102在509.5nm处测得吸光度值,以显色15 min后的时刻设为0时刻,得出结果(见表2)。�
由表2得,RSD%为1.94%,说明芦丁的显色反应的稳定性良好,样品溶液应在显色后三小时内完成含量测定。�
2.4.6 加样回收率 取0.5 g/份金樱叶粉末共6份,按含量测定结果,1�∶�1加入芦丁对照品(与样品中黄酮量1:1),按提取方法提取,过滤,取滤液,按“2.4.3”项下方法操作测定吸光度,并计算总黄酮量。计算所得平均回收率为99.7%,RSD%为2.4%。结果如下(见表3)。�
2.5 正交试验结果
精密称取脱脂金樱叶粉末每份0.5 g按L�9 (3�4)正交设计设计方案进行试验,所得提取液抽滤,定容至50 ml容量瓶中,摇匀,制得9个供试品溶液,测定9个样品的吸光度,根据标准曲线计算样品含量(见表4)。�
试验结果表明,各因素对提取效果的影响从大到小依次为乙醇浓度、固液比、提取时间、超声功率。由表4中R值可得出:乙醇浓度和固液比为主要影响因素,提取时间和超声功率为次要影响因素。最佳的超声提取工艺条件为A1B2C2D2和A1B3C3D3,计算所得的最优工艺为A1B2C3D2。从表4中可得因素B的R值为0.394, 影响不大;而因素C优选的2个工艺结果相差并不大,但就工业生产成本而言,时间越少,对工业生产越有利,成本也相对减少;而因素D的极差值R较大,表明固液比对提取的影响较大,但溶剂的减少可以避免造成浪费,也可以节省成本开支。因此,从省时、省能等方面出发,综合各种因素,得出最佳的总黄酮提取工艺为A1B2C2D2,即为1:40的固液比下,超声频率为28KHz,90W功率下,以浓度为50%的乙醇超声提取60 min。�
2.6 验证实验 按照A1B2C3D2 进行验证试验,由表6中结果看,RSD%为1.97%,实验证明本实验的所得的提取工艺重复性良好。�
3 讨论�
本实验选用硝酸铝试剂进行黄酮的显色反应,而试验结果表明,芦丁的显色反应稳定性好,可选用芦丁作为对照品。本实验用超声提取的方法提取,经过预试验选出,预试验中,用超声法提取金樱叶,总黄酮的提取量比回流提取法的提取量稍多,且超声提取法与回流提取法相比,提取时间较少,操作较方便。�
由于金樱叶是常绿植物,含有大量的叶绿素,叶绿素的存在,不仅会造成视觉上无法判断黄酮的存在与否,甚至可能会影响黄酮在紫外下的测定结果。浓度越大的乙醇所提取出的叶绿素也越多,叶绿素的存在令提取液的颜色变成绿色,难以判断黄酮的存在,也影响显色结果。综合因素,实验前去除金樱叶中叶绿素,减少影响因素是必要的。�
经过多次实验,利用单因素实验和正交试验法得到一个可行的金樱叶总黄酮提取工艺:以50%的乙醇作为提取溶剂,以1:40的固液比,在超声28KHz、90W条件下进行超声60 min,总黄酮得率为11.64%,RSD%为1.97%。�
参 考 文 献�
[1] 中华本草编委会.中华本草(苗药卷).贵州科技出版社,2005:378-379.�
[2] 张英慧,徐誉泰.拓术根黄酮注射液对小鼠S-180肿瘤的抑制作用.佛山科学技术学院学报,2001,19(3):75-77.�
[3] 董涛.中药金樱叶的化学成分研究.第二军医大学,2009.��
