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摘要：［目的］ 研究壬基酚（p-nonylphenol，NP）对细胞色素P450芳香化酶基因(P450arom)和苗勒氏管抑制物基因(MIS)表达的影响，探索其对鱼类雌激素样作用的分子机制。［方法］ 日本比目鱼在性分化过程中能随环境因子改变而发育为不同性别，在幼鱼孵化后第30天到第100天性分化敏感期于27℃水温下，给予幼鱼投食NP 100 μg/g饲料。分别对各组比目鱼生殖腺做病理组织切片，判断其性别和雌雄比例，并通过原位杂交方法结合RT－PCR分析第100天青年期鱼生殖腺中P450arom和MIS mRNA的表达，观察NP对比目鱼性分化标志基因的作用。［结果］ NP对27℃水温饲养下的比目鱼幼鱼有一定程度的雌性化诱导作用，成年雌性的百分比为30%，高于27℃水温对照组（0%）；比目鱼幼鱼出生后第100天时对其生殖腺进行原位杂交分析显示，P450arom的mRNA在各组的雌鱼卵巢中有明显表达，但在雄鱼精巢中未见表达；而MIS的mRNA在各组的雌鱼卵巢中不表达，却在雄鱼精巢中能见到很明显的表达。RT－PCR分析也显示，P450芳香化酶的mRNA仅仅在雌鱼卵巢中表达，而MIS也仅仅在雄鱼精巢中表达，证实了原位杂交实验的结果。 ［结论］ 在日本比目鱼体内，NP染毒可以诱导P450芳香化酶mRNA表达并抑制MIS的mRNA的表达，从而对生殖腺性分化期的幼鱼发挥雌激素样干扰作用。
关键词： 壬基酚； 芳香化酶P450； 苗勒氏管抑制物; 雌激素样作用 中图分类号：R 114, R 99 文献标识码： Ａ
Effects of p-nonylphenol on the expression of P450arom and MIS genesYANG Jun1,2, ZHONG Wei-jian�2,ADACHI Ryuta�3,KITANO Takeshi�3，ABE Shin-ichi�3( 1. School of Public Health, Fudan University, Shanghai 200032,China;2. Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336,China; 3. Department of Materials and Life Science, Graduate School of Science and Technology, Kumamoto University, Kumamoto860-8555, Japan)
Abstract: ［Objective］ To elucidate the effect of p-nonylphenol (NP) on cytochrome P450 aromatase (P450arom) gene and Müllerian inhibiting substance (MIS) gene in fish gonad, exploring the mechanism of its estrogenic action.［Methods］ Treatment with NP to Japanese flounder, a teleost that exhibits temperature-dependent sex determination, was carried out by providing the larvae with an artificial diet mixed with 100μg/g of NP at a masculinizing temperature (27℃) from 30 to 100 days after hatching. Phenotypic sex was determined at 100 (juvenile stage) and 300 dah (adult stage) by histological observation. Sex ratio, P450arom and MIS mRNAs expression in the genetically female flounder treated with NP were examined by in situ hybridization and RT-PCR analyses. ［Results］ Treatment with 100μg/g diet of NP induced feminization of the flounder larvae reared at 27℃ with female percentages of 30%. The result of in situ hybridization and RT-PCR analyses showed that feminization of the larvae by NP was accompanied by up-regulation of P450arom mRNA expression and down-regulation of MIS mRNA expression in female gonad at 100 days after hatching. ［Conclusion］In Japanese flounder, treatment of NP can induce the expression of P450arom gene and suppress the expression of MIS gene, excerting its estrogenic disruption on gonadal sex differentiation in fish.
Key words: p-nonylphenol; P450arom; Müllerian inhibiting substance; Estrogenic action
壬基酚(p-nonylphenol，NP) 是一种工业生产过程中排放入环境的污染物，最近很多研究报道它是一种存在于环境中的雌激素样化学物质，这类物质能影响哺乳动物的雌性生殖腺、第二性征、月经周期规律、妊娠和泌乳［1］，从而在生殖、发育、免疫等系统中有内分泌干扰的危害作用。有报道称，在一种有雌雄性别决定机制［2］的淡水小鱼－青�鱼中，从第二性征判断，暴露于4-NP可使青�鱼性别比例偏向雌性［3］，提示4-NP是一种雌激素样化学物，具有改变性别发育的作用潜力。国外在这方面近年来做了很多研究工作，然而NP对鱼类雌激素样作用的具体机制仍不够明确。日本比目鱼是一种硬骨鱼，且具有XX(雌性)/XY(雄性)性别决定机制［4］。研究表明，遗传型雌鱼的幼鱼在性分化时期如果被喂养在27℃水温条件下，所有鱼的性别可以被转化成为表型的雄鱼［5］。因此这种鱼是研究性分化作用分子机制的良好动物模型。此外，在27℃水温下喂养这种幼鱼，外源性雌二醇能够诱导它们生殖腺雌性化，这为研究NP这类雌激素样化学物对日本比目鱼的生殖腺性分化的作用机制提供了基础，我们在27℃水温下对比目鱼幼鱼喂食NP，检测鱼类生殖腺内的两个性别特异性指标P450arom和MIS mRNA的表达水平。
1 材料与方法
1.1 仪器
ADVANTEC培养箱CI410，TOMY蒸汽高压灭菌仪BS245，TOMY高速冷冻小型离心机MX100，ASTEC PCR仪，OLYMPUS显微镜。
1.2 试剂
壬基酚（NP），购自日本和晃公司。
1.3 实验动物及染毒方法
实验中所有遗传学雌性日本比目鱼是用遗传学雌性和表型雄性比目鱼人工交配得来的［5］。幼鱼孵化后饲养在18℃低水温中直到染毒开始时为止。NP染毒方法是将NP按 100μg/g饲料的比例拌入人工饲料，在27℃水温下于幼鱼性分化时期喂食NP，即从鱼卵孵化后第30天到第100天对其染毒。另设18℃水温组、27℃水温组和1μg/g雌二醇
（E2）阳性组。
1.4性别判断
将比目鱼生殖腺固定于Bouin’s溶液里，置于4℃过夜，用乙醇脱水和石蜡包埋，连续切片5 μm厚，最后H.E.染色，镜检。表型性别的判断是通过对它们生殖腺的组织学观察来决定的［6］。
1.5 原位杂交法检测基因的表达
在RNA酶灭活条件下，将第100天的青年期小鱼的组织切片用1μg/mL的蛋白酶K磷酸缓冲液处理5 min，室温下，加入2 mg/mL氨基乙酸终止此反应5 min。组织玻片在磷酸缓冲液中漂洗2次后，用4％多聚甲醛磷酸缓冲液固定10 min，再漂洗2次后，组织切片与1μg/mL DIG标记的反义RNA探针杂交，此探针包含日本比目鱼P450arom和MIS的cDNA［7］。在DIG Easy Hyb溶液中于55℃反应。杂交后的组织切片在50％甲酰胺溶液中漂洗2次，每次30 min。再用RNase A 于37℃下反应30 min，使用DIG核酸检测试剂盒（罗氏公司）测试mRNA的表达信号。
1.6 RT-PCR法检测基因的表达
总RNA是通过ISOGEN从第100天的青年期比目鱼的生殖腺中提取的：生殖腺在100 μL ISOGEN中被均质化，在均质液中加入20 μL氯仿，螺旋振荡5s，15000转/min离心15 min，移去上清液，转入新离心管内，加40 μL异丙醇，15000转/min离心30 min。移去上清液后，总RNA沉淀用70％乙醇洗涤，空气中干燥后溶于DEPC处理过的水中。RT反应使用RNA PCR试剂盒和温度循环仪完成。第一链cDNA合成于总RNA，总RNA在65℃中变性10 min，于42℃下在RT混合液中共同培养30 min，再于99℃ 5 min。PCR反应使用P450arom、MIS和延长因子（EF－1α）基因特异性引物对，引物对序列为P450arom：5"-ATC GGA TCC CTG CCT GTG AC-3, 5"-TGGCTG ATG CTC TGC TGA GG-3"；MIS：5"-TGA CCC GTA CCT ACG AGC TG-3", 5"-TCG TCC ACG TTC TCG CTC TC-3"；EF-1α：5"-AGT TCG AGA AAG AAG CTG CC-3", 5"-ATC CAG AGC ATC CAG CAG TG-3" 扩增长度分别为344 bp，291 bp和577 bp，循环数分别为30，25和25次。使用转录产物cDNA作为PCR混合液中的模板。PCR条件是：95℃预热10 min，94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1 min，末次延伸于72℃ 5 min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，在溴乙锭溶液中染色，UV灯下成像。
2结果
2.1 NP暴露对比目鱼性别决定的干扰
本次研究从组织学上观察了18℃水温组27条鱼、27℃水温组40条鱼、E2组23条鱼、NP组20条鱼，从图1中可见，当遗传学雌性幼鱼给予正常食料喂养并控温在18℃时，组织学检查发现鱼的生殖腺分化为椭圆的含有卵巢腔的雌性生殖腺－卵巢（Tanaka曾报道卵巢腔是比目鱼性腺分化过程中雌性特有的形态学标志［8］），说明几乎所有幼鱼都能发育成正常雌鱼（雌性占96.3％）。然而，当幼鱼被喂养在27℃水温时，所有比目鱼都发育成表现型的雄鱼（雌性比例为0％），可以观察到生殖腺发育成狭长的精巢，不含有卵巢腔。与此相比， E2组和NP组染毒后，即使幼鱼饲养在27℃水温，仍被全部或部分诱导分化成雌鱼，E2组雌性占100％，NP组雌性占30％；而且，组织学检查中也没有发现卵巢－精巢同体的比目鱼，能准确判断这种鱼的性别。
图1 NP暴露对比目鱼的雌性化诱导作用
2.2 P450arom基因表达的强度
表1说明了原位杂交分析的各组比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中P450arom mRNA的表达。在18℃对照组、E2组和NP组的雌性生殖腺中P450arom mRNA有显著表达；而在27℃模型组的雄性生殖腺中没有表达。
表1 原位杂交检测第100天生殖腺中P450arom基因的表达
[JZ]组别卵巢腔P450arom mRNA的表达有明显无未见有明显有明显
2.3 MIS基因表达的强度
由表2可见原位杂交分析的各组比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中MIS mRNA的表达。在18℃对照组、E2组和NP组比目鱼的雌性生殖腺中MIS mRNA几乎没有表达；而在27℃模型组的雄性生殖腺中有极其明显的表达。
表2比目鱼生殖腺中MIS基因的表达
组别[]MIS mRNA的表达未见极强未见未见
2.4 RT-PCR检测基因表达的性别特异性
图2显示RT-PCT分析每组各3条比目鱼第100天性成熟的青年期生殖腺中P450arom和MIS mRNA的表达，也进一步验证原位杂交获得的结果。在NP组(A)1条雌鱼和18℃对照组(B)全部雌鱼的生殖腺中P450arom mRNA有显著表达，但这些生殖腺中MIS mRNA几乎没有表达；而在27℃模型组(C)全部雄鱼和NP组(A)的2条雄鱼的生殖腺中P450arom mRNA没有表达而MIS mRNA有显著的表达。
图2 比目鱼幼鱼体内P450arom和MIS基因RT-PCR
扩增产物的凝胶电泳图
3 讨论
本研究中发现，壬基酚诱导比目鱼幼鱼雌性化的同时伴随着芳香化酶P450（P450arom）mRNA表达的上调。北野曾报道，在27℃水温下饲养日本比目鱼，或者用芳香化酶抑制剂法倔唑（fadrozole）喂食以及用17α-甲基睾酮染毒都能诱导遗传学雌性比目鱼性别转换为雄性，同时检测到对P450arom mRNA表达的抑制［9］，提示P450arom这种在体内催化雄激素转化为雌激素的酶及其产物－内源性雌激素在比目鱼卵巢分化过程中发挥着很重要的作用。壬基酚很可能通过先诱导了P450arom表达而干扰鱼的性腺分化过程。
MIS被称为苗勒氏管抑制物质，或叫做抗苗勒氏管激素。它是一种糖蛋白，属于转化生长因子β（TGF-β）总科［10］。在雄性哺乳动物胎儿体内，MIS负责苗勒氏管（雌性动物生殖管原基）的退化。如果胎儿的卵巢暴露于MIS作用后，P450arom的mRNA表达会受到抑制［11,12］。另一方面，吉永证明，在日本比目鱼生殖腺性分化期将其饲养在27℃水温，或者用一种雄激素11-KT染毒后，表型雄鱼的精巢中MIS的mRNA有非常明显的表达，但在雌鱼的卵巢中难以检测到它，提示在比目鱼精巢分化过程中，MIS起着很大的作用［7］。本次研究发现，NP诱导幼鱼雌性化的同时检测到MIS mRNA表达的下调，说明NP可能还具有抑制MIS而维持卵巢发育这一作用机制。
本研究中，在27℃雄性化水温中，用含雌二醇（E2）饲料喂养比目鱼幼鱼，仍可以完全诱导它们雌性化，并且在同一个生殖腺中P450arom的mRNA表达被诱导而MIS的mRNA表达受到抑制。而NP对27℃水温中幼鱼的雌性化作用的同时也伴随着这一现象，这提示了NP干扰性分化的作用机制很可能与雌激素一样，先通过调节P450arom和MIS mRNA的表达而发挥雌性化作用。这也提示了P450arom和MIS两个基因可以作为鱼类接触壬基酚的早期反应预警标志物，尽早预防它对人体尤其婴幼儿生殖发育系统的危害。今后可以在NP对P450arom和MIS两个基因的转录调节途径分子机制方面作更深入的研究。
4 参考文献
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(收稿日期：2006-07-17)
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