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【摘要】 目的 中药贯叶连翘因其显著的药理作用及临床应用效果受到人们越来越多的关注。介绍了贯叶连翘的主要化学成分,包括萘骈二蒽酮类化合物、间苯三酚类化合物及黄酮类化合物等;概述了其活性成分的分离纯化及HPLC检测方法的研究进展.拟为大量制备贯叶连翘活性成分以及相关药物的质量控制提供研究基础。
【关键词】 贯叶连翘;金丝桃素;贯叶金丝桃素;金丝桃苷;分离;纯化
连翘(Hypericum perforatuml),又名贯叶金丝桃、圣约翰草(St.John’s wort),是藤黄科金丝桃属植物.随着对其药理活性研究的深入,贯叶连翘越来越受到人们的重视。贯叶连翘的主要活性成分贯叶金丝桃素、金丝桃素、金丝桃苷等具有抗抑郁、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、止咳、镇痛等作用。目前,用贯叶连翘提取物制成的制剂已在欧美大量上市,主要用于治疗抑郁症[1]、甲型和乙型肝炎及艾滋病等[2]。此外,还有文献报道其有抗肿瘤活性。本文概述了这些成分的分离纯化和含量测定技术的研究进展情况,拟为改进提取纯化工艺提供研究基础。
1 贯叶连翘的化学成分
贯叶连翘提取物成分复杂,不同成分的药理活性不尽相同,成分之间的协同作用也可用于某些疾病的治疗。贯叶连翘的活性成分主要有几大类。
1.1 萘骈二蒽酮类 萘骈二蒽酮类(naphtodianthrones)化合物主要包括金丝桃素(hypericin)、伪金丝桃素(pseudohy-pericin)、原金丝桃素(proto-hypericin)、原伪金丝桃素(protopseudohypericin)、环伪金丝桃素(cyclopseu-do-hypericin)等。
这些成分的结构如下。
贯叶连翘全草中金丝桃素的含量较低,仅有万分之几,伪金丝桃素的含量通常比金丝桃素高2~3倍,原金丝桃素、原伪金丝桃素主要存在于新鲜植物中,在日光照射下会分别转化为金丝桃素和伪金丝桃素。环伪金丝桃素则是伪金丝桃素的氧化产物。纽约大学医学中心研究指出,金丝桃素通过影响艾滋病病毒复制循环的装配与释放过程从而抑制艾滋病病毒活性。还有实验表明,金丝桃素可抑制艾滋病病毒感染细胞中分离的整合酶,说明金丝桃素可能影响病毒的整合作用。金丝桃素是一种光敏性物质,其的抗病毒机制与其光敏活性有关。近年来,由于禽流感盛行,人们加紧研究治疗和预防禽流感的药物。有报道称,金丝桃素有一定的抗禽流感H5N1和H9N2亚型病毒的作用。华南农业大学P3实验室的临床试验表明,农业部重点实验室研制的金丝桃素制剂对人工感染的H5N1亚型禽流感家禽活体具有100%的治愈率,对H9N2亚型禽流感病毒也有一定的抑制作用。另有研究表明,金丝桃素还具有抗肿瘤作用。临床上已经利用金丝桃素的光动力学疗法有效地治疗了基体细胞癌、胰腺癌、膀胱癌,以及各种肿瘤,甚至脑瘤,分子药理学和临床实验证实,金丝桃素可以选择性地富集在肿瘤组织周围,而对健康组织损伤很小,有望发展成为一种新型的抗肿瘤药物。金丝桃素的抗肿瘤活性也与其光敏活性和光动力作用有关,其与肿瘤结合后受光照射,通过诱导肿瘤细胞凋亡和坏死两种途径实现对肿瘤细胞的毒性作用[3]。
1.2 间苯三酚类 间苯三酚类(phloroglucinols)化合物主要包括贯叶金丝桃素(hyperforin)和加贯叶金丝桃素(ad-hyperforin)[6],贯叶金丝桃素为贯叶金丝桃的特性成分,发现贯叶金丝桃素能抑制5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)等单胺类神经递质和γ-氨基丁酸(GABA)、L-谷氨酸等氨基酸类神经递质的重吸收,其是抗抑郁作用的主要成分。研究表明,其作用很可能是通过提高突触体细胞内钠离子浓度或通过降低突触体内突触小泡的跨膜pH梯度实现的。此外,贯叶连翘的黄酮类成分被认为具有抑制单胺氧化酶(MAO)的作用,金丝桃素被认为具有抑制mACHR和sigma等神经受体的作用,所以,也有研究认为贯叶连翘的抗抑郁作用是以贯叶金丝桃素为主要活性成分的多种成分协同作用的结果。也有研究发现,贯叶连翘提取物的抗抑郁作用与贯叶金丝桃素的浓度密切相关,从而进一步确信贯叶金丝桃素是抗抑郁的主要活性物质,但对其真实的作用机理还需作进一步研究。贯叶金丝桃素制剂的抗抑郁作用明显优于安慰剂,其疗效与标准抗抑郁药马普替林、丙咪嗪、阿米替林相当,但毒副作用比它们小很多,费用也相对较低。当前国内对贯叶连翘的研究多集中在金丝桃素及金丝桃甙上,抗抑郁活性极高的贯叶金丝桃素尚未引起重视,在制剂标准和提取工艺上忽略了对贯叶金丝桃素的研究,若能结合中西医理论及大量临床经验,加大对活性成分贯叶金丝桃素的开发力则可以填补国内精神治疗药物的一项空白 [3]。
丝桃素和加贯叶金丝桃素的结构如下。
1.3 黄酮类 贯叶连翘含有多种黄酮类(flavonoids)成分,其中活性成分为金丝桃苷(hyperoside)又叫金丝桃甙(hyperin)。金丝桃苷在金丝桃素属植物中广泛存在,其对钙内流有较强的选择性,有阻滞作用,对心肌缺血再灌损伤具有保护作用;金丝桃苷还具有明显的抗炎作用、有较强的止咳作用、外周止痛作用和中枢镇痛作用;金丝桃苷还有较强的抑制眼醛糖还原酶的作用,可能对预防糖尿病性白内障有利。另外,叶和花中槲皮素(quercetin)的含量为0.10%~0.58%。植株的所有部位皆含芦丁(rutin),发芽期叶中的含量为2%。贯叶连翘中还含有槲皮苷(quercitrin)、异槲皮苷(isoquercitrin)等[3]。
黄酮类成分结构如下。
1.4 其他类成分 贯叶连翘中还含有挥发油、鞣质、原花青素、胡萝卜素、B2谷甾醇、异缬草酸、月桂酸和肉豆蔻酸等成分。其中挥发油含量为0.059%~0.350%,主要为单萜(以A2和B2蒎烯为主)和倍半萜、碳氢化合物等。鞣质含量约3%~16%,具有解毒、止泻等功效。原花青素(包括二、三、四聚体及儿茶精和表儿茶精的多聚体)含量达12%,具有调节血脂等功效[3]。
2 活性成分的粗提取方法
贯叶连翘的活性成分主要包括金丝桃素、贯叶金丝桃素、金丝桃苷,金丝桃素分子式C��30�H��16�O�8,分子量504.46,为棕褐色粉末,不溶于水,见光易分解。贯叶连翘全草中金丝桃素的含量为万分之几,目前国际市场对贯叶连翘提取物中金丝桃素的含量要求是必需大于0.3%。贯叶金丝桃素分子式C��35�H��52�O�4,分子量536.77,熔点79~80℃,不溶于水,易溶于非极性有机溶剂如正己烷、石油醚等。贯叶金丝桃素也极不稳定,在光、热和氧气等作用下很容易被氧化。在贯叶连翘的花和果中,贯叶金丝桃素的含量为2.0%~4.5%,美国药典(USP)中规定,贯叶连翘提取物的质量标准为贯叶金丝桃素含量不得低于3%。金丝桃苷分子式C��21�H��20�O��12�,分子量464.37,熔点:227℃~230℃。其含量在花中达到3%,在叶中达到1.05%~1.80%。
2.1 金丝桃素的提取方法
2.1.1 乙醇提取法 用乙醇作溶剂从贯叶金丝桃中提取金丝桃素是一种比较常用的方法,但是乙醇的浓度和提取温度对金丝桃素的提取率和得率影响显著。研究表明,80%乙醇水溶液,在80℃提取金丝桃素效果相对较好,粗提物中金丝桃素含量可达0.34%,提取率为7%。
2.1.2
碱液提取法 李俊等提出使用碱液提取法提取贯叶连翘中的金丝桃素。具体方法是:称取一定量干燥粉碎的贯叶连翘全草,加入30倍原料重的1%NaOH溶液,在95~100℃沸腾状态下浸提2 h,多次提取后,滤液用0.1 mol/L HCl溶液中和至pH值为3,真空浓缩干燥即得产品。粗提物中金丝桃素的含量可达1.5%。此方法的缺点是产品中有大量NaCl夹带其中,为提纯带来许多不便。
2.1.3
超临界CO�2萃取法 也有尝试采用超临界CO�2萃取技术提取贯叶连翘中金丝桃素。以乙醇为夹带剂,在压力为4.5×107Pa,温度为328 K的萃取条件下,所得的提取物可以达到出口标准,即金丝桃素含量不少于0.3%。收率可达5.95%。上述3种方法普遍的优点是操作简便易行,缺点是提取物中目标物质金丝桃素的含量仍比较低,都需要进一步的纯化
2.2 贯叶金丝桃素的提取方法
有研究报道采用超临界CO�2萃取法粗提取贯叶金丝桃素。由于贯叶金丝桃素极性较弱,可以不用夹带剂,在压力为3×107Pa,萃取温度323 K的条件下,所得提取物中贯叶金丝桃素含量达2.91%。
2.3 金丝桃苷的提取方法
有研究者对金丝桃苷的几种粗提取方法进行了对比研究。对贯叶连翘中金丝桃苷采用乙醇热回流提取、甲醇热回流提取,乙醇超声提取、甲醇超声提取等方法提取。采用15倍于药材重量的70%的乙醇热回流提取两次,第1次提取60 min,第2次提取30 min,所得产品中金丝桃苷含量较高,可达到1.411%。
3 活性成分的分离纯化方法
3.1 金丝桃素的分离纯化方法 大孔树脂吸附分离法。研究表明,贯叶连翘醇提物用D101大孔吸附树脂吸附后,用40%乙醇可洗脱大量杂质,80%乙醇可解吸吸附树脂柱上的金丝桃素。该方法得到的产品中总金丝桃素含量可达2.13%,提取率为81.3%。
大孔树脂吸附结合硅胶柱色谱分离法。令贯叶连翘的醇提物通过S898吸附树脂,用无水乙醇洗脱,收集洗脱液,浓缩干燥,用丙酮溶解干燥产物后通过硅胶柱分离,收集洗脱液,浓缩干燥后,得红色的金丝桃素产品,其含量为4.26%。
3.2 贯叶金丝桃素的分离纯化方法
薄层色谱法。使用硅胶GF254薄层板,正己烷-乙酸乙酯(5∶1,V/V)为展开剂,充分洗脱,可得到纯度为76.64%的贯叶金丝桃素。将薄层色谱得到的贯叶金丝桃素再经反相C18柱制备液相色谱分离,以甲醇为流动相,可得纯度高于98%的贯叶金丝桃素产品,硅胶柱色谱法,采用一般的硅胶柱色谱,流动相为正己烷-乙酸乙酯(6∶1,V/V)可以得到纯度为61.14%的贯叶金丝桃素。
3.3 金丝桃苷的分离纯化方法 用硅胶柱色谱分离,以石油醚-丙酮、氯仿-丙酮或氯仿-甲醇-水梯度洗脱,改变洗脱条件,可达到较好的分离效果。经重结晶,可得到较纯净的金丝桃苷。随着人们对贯叶金丝桃提取物药理活性研究的不断深入,对其中活性成分金丝桃素、贯叶金丝桃素、金丝桃苷的提取、分离纯化技术也已提出了更高的要求。
4 活性成分的高效液相分析方法
采用反相高效液相色谱法(HPLC),测定金丝桃素的含量。用Nucleosil C18(15×0.4 cm)色谱柱为固定相,采用3 min梯度洗脱,以甲醇-水(7∶3)为流动相开始洗脱,结束时甲醇量达到100%;流速为0.9 ml/min;采用二极管阵列检测器,特征吸收波长选为590 nm。该方法可用于贯叶连翘药材及其提取物中有效成分金丝桃素的质量监测。
采用反相高效液相色谱法,测定贯叶金丝桃素的含量。样品用甲醇溶解,浓度1 mg/ml,经0.45 μm滤膜过滤后,用Waters C8(150 mm×4.6 mm,i.d.3.5 μm)色谱柱作为固定相,流动相用甲醇-乙腈-丁醇-磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH=7.4)55∶18∶1∶26,V/V,流速为0.8 ml/min,工作温度:室温。采用紫外-可见光检测器,检测波长300 nm。该方法可用于贯叶连翘药材及其制剂的质量监测。
采用反相高效液相色谱法,测定金丝桃苷的含量。用依利特Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×200 mm,5 μm)作为固定相,流动相为甲醇-0.5%磷酸(45∶55,V/V,用三乙胺调pH至3.0),检测波长360 nm,流速1.0 ml/min,柱温35℃。金丝桃苷在0.197 2~1.97 2 μg/L范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9),平均回收率为100.8%,RSD=1.5%。该方法快捷、简便,结果准确、可靠,可作为贯叶连翘药材及提取物中有效成分金丝桃苷的质量监测。
5 结论
虽然国内外对贯叶连翘原植物栽培、化学成分、药理和临床进行了大量的研究,但对其制备工艺的深入研究较少。针对贯叶金丝桃活性成分金丝桃素、贯叶金丝桃素、金丝桃苷的现有分离提纯技术,存在提取效果差、提取物含量低、分离效率低等问题。贯叶连翘的进一步药理活性研究及相关药物的质量监控都对其高效的活性成分分离纯化方法提出了更高要求。建立一种安全、高效、经济的贯叶连翘活性成分提取纯化方法,不仅对相关药物开发具有重大意义,而且会带来巨大的社会和经济效益。可以看出,对改进分离提纯方法的进一步研究是我们现在必须面对的问题。
参 考 文 献
[1] 张峰,李法曾.贯叶连翘对应激大鼠生长和脑单胺类神经递质含量的影响.动物学研究,2008,29(1):63-68.
[2] 徐皓.贯叶连翘的化学成分及药理作用研究.安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci,2007,35(14):4219-4221.
[3] 李艳,等.贯叶连翘的化学成分及其提取方法研究进展.北京工商大学学报(自然科学版),25.6.
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[5] 张立伟.山西大学研究生毕业论文,中药连翘有效成分连翘酯甙分离提取及药效学活性研究.
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