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【摘要】目的:利用高效液相色谱法(HPLC),研究并建立了制备克感利咽口服液主成分色谱图的色谱方法。方法:色谱条件: Kromasil C18柱 (4.6mm×250mm,5μm); 流动相为乙腈和0.25%甲酸水溶液,梯度洗脱,流量1.0mL/min;柱温22℃;用二极管阵列检测器记录各个色谱峰的紫外吸收光谱,色谱检测波长254nm。结果:在优化实验条件下,同时检测11种药效物质。结论:利用HPLC,从克感利咽口服液中鉴别出含有黄芩苷、黄芩素、绿原酸、栀子苷4种主要化学成分。� 【关键词】高效液相色谱;药效物质
Application of high performance liquid chromatographyto
determinepharmacodynamic substances in Rheumand Pharyngitis Oral Solution
XIE Cheng�en1 DING Jin�long2 LIU Hong1
【Abstract】Objective: Using High Performance Liquid Chromatography (HPLC), the chromatogram and preparative method were studied and established for qualitative analysis on the chemical compositions of Rheumand Pharyngitis Oral Solution. Methods: HPLC conditions: Kromasil C18 column (4.6mm × 250mm, 5μm); mobile phase of acetonitrile and 0.25% formic acid aqueous solution, gradient elution, flow rate 1.0mL/min; column temperature 22 ℃; with diode array detector records of all chromatographic peaks of UV absorption spectra, HPLC detection wavelength 254nm. Results: Optimization of experimental conditions, 11 kinds of pharmacodynamic substances could be detectedin the same time. Conclusion: The use of HPLC, identify Rheumand Pharyngitis Oral Solution containing baicalin, baicalein, chlorogenic acid and geniposide, four kinds of main chemical components.
【Key words】HPLC;pharmacodynamic substances
【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)08-0152-02
应用现代仪器分析技术对中药成分进行分离和分析,结合药理学的药效试验,构成了探讨中药物质基础研究的基本方法。研究表明[1],克感利咽口服液由金银花、黄芩、栀子等14味中药材组成,对甲3型、乙型流感病毒以及呼吸道常见致病菌有杀伤和抑制繁殖作用。本研究利用HPLC方法对黄芩苷、黄芩素、绿原酸、栀子苷、升麻苷、连翘苷、甘草苷、甘草酸铵、5-0-甲基维斯阿米醇苷、次野鸢尾黄素、胡薄荷酮11种混合对照品及克感利咽口服液进行色谱分析,综合各样品色谱峰保留时间及紫外吸收光谱信息,建立克感利咽口服液主成分HPLC色谱图制备方法,对其中的主要药效物质进行定性检测。
1 材料与方法
1.1 仪器:Waters 2695型高效液相色谱仪, 2996PDA检测器,Empower色谱工作站(美国Waters公司)。
1.2 对照品及试品溶液制备:分别取对照品(中国药品生物制品检定所):黄芩苷0.00203g、黄芩素0.00153g、绿原酸0.00190g、栀子苷0.00141g、升麻苷0.00133g、连翘苷0.00138g、甘草苷0.00235g、甘草酸铵0.00230g、5-0-甲基维斯阿米醇苷0.00156g、次野鸢尾黄素0.00125g、胡薄荷酮0.00152g置10ml容量瓶中,加甲醇溶解,摇匀,定容至刻度,以0.45μm微孔滤膜过滤,滤液作为混合对照品供试溶液。精密吸取克感利咽口服液(广州王老吉药业股份有限公司)2ml,置25ml量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,摇匀,以0.45μm微孔滤膜过滤,滤液作为克感利咽口服液样品溶液。
1.3 试剂:甲醇和乙腈均为色谱纯(美国Tedia公司),甲酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂开发公司);水为超纯水。
1.4 方法:色谱条件为色谱柱:迪马Kromasil C18柱 (4.6mm×250mm,5μm);保护柱:Phenomenex KJ0-4282 C18 (4.0mm×3.0mm);二元梯度流动相,A为0.25%甲酸水溶液,B为乙腈,洗脱梯度:0―10min(2% B―5% B),10―30min(5%B―15% B),30―60min(15% B―30% B),60―75min(30% B―60% B),75―80min(60% B),80―85min(60% B―2% B);流速:1mL/min;柱温:22℃;检测波长:254nm;进样量:10μL。
2结果与讨论
2.1 色谱条件的选择:结合一些相关的文献报道[2-4],对色谱条件进行优化。实验分别以乙腈-0.25%甲酸水溶液为流动相1,甲醇-0.25%甲酸水溶液为流动相2,乙腈与甲醇流动相梯度变化。与甲醇相比,乙腈作为混合流动相中的有机相时,样品完成单个样品进样需时明显较短,而且所能提供的样品信息明显较多,色谱峰的分离度也较高。实验分别考察了甲酸、乙酸和磷酸对色谱峰的影响,固定水相中弱酸浓度为0.25%,分别以乙腈-0.25%甲酸水溶液为流动相1,乙腈-0.25%乙酸水溶液为流动相2,乙腈-0.25%磷酸水溶液为流动相3,分别以0.25%甲酸、乙酸和磷酸为昆混合流动相的水相时,对色谱图总体上并未表现出显著的差异;但在局部存在一定差异,甲酸优于乙酸,与磷酸效果类似。实验进而对甲酸浓度的选择进行了考察。不同浓度甲酸水溶液(1.0%、0.5%、0.25%)对色谱图并未表现出显著的差异,但在一些细节部位,0.25%浓度的甲酸获得的色谱峰有着更好的分离度,反映出更多一些信息。按照对样品稳定性及对色谱柱适用条件的选择原则,本实验验最终确定了1.4的流动相条件。在20~30℃色谱柱温对克感利咽口服液主成分色谱图并无显著影响,同时考虑到本实验所有仪器设备情况,实验选择色谱柱柱温22℃。
分别考察在不同检测波长(220nm、241nm、254 nm、265nm、277nm、300nm、327nm、360nm)下的色谱图,其中以254nm下的信息量较为丰富,而且色谱峰的表观丰度高,选择254nm作为制备色谱图的检测波长。
因不同的色谱柱柱效可能存在差异,比较了四种不同的色谱柱对克感利咽口服液主成分色谱图的差异。色谱柱分别为:迪马Kromasil C18柱,依利特Hypersil ODS C18柱,菲罗门Luna C18柱,沃特斯Symmetry C18柱,均为4.6mm×250mm,5μm。实验最终选择迪马Kromasil C18柱用于制备色谱图。
2.2 主成分色谱图特征峰的提取:作为一种的复方中药制剂,克感利咽口服液由14味中药组成中化学成分非常复杂,利用HPLC初步获得了色谱信息丰富、各色谱峰分离度较好而色谱分离时间相对较短(80min内)的克感利咽口服液主成分色谱图。通过与各对照品色谱保留时间及紫外吸收光谱比较分析, 5号峰为绿原酸,7号峰为栀子苷,14号峰为黄芩苷,18号峰为黄芩素。
2.3 稳定性试验:
取同一份供试品溶液分别在0、2、4、6、8、12、24h不同时间点进行检测,结果色谱各特征峰保留时间的RSD介于0.03%~0.94%,各特征峰保留时间稳定;色谱各特征峰峰高的RSD介于0.51%~4.66%,各特征峰峰高稳定;色谱图相似度皆在0.99以上,因而色谱图稳定,从而表明样品在24h内稳定。
2.4 精密度试验:
取同一份供试品溶液,连续进样检测6次,结果色谱各特征峰保留时间的RSD介于0.01%~0.99%,各特征峰保留时间稳定;色谱各特征峰峰高的RSD介于0.55%~4.52%,各特征峰峰高稳定;色谱图相似度皆在0.99以上,因而色谱图稳定,从而表明仪器稳定,进样精密度良好。
2.5 不同批次克感利咽口服液比较:对10批不同生产批次的产品进行HPLC分析,前面建立克感利咽口服液主成分色谱特征峰在10批次产品中皆存在;与对照图谱比较,各批产品的色谱相似度也皆在0.9以上。
3 小结
3.1 建立了对对黄芩苷、黄芩素、绿原酸、栀子苷、升麻苷、连翘苷、甘草苷、甘草酸铵、5-0-甲基维斯阿米醇苷、次野鸢尾黄素、胡薄荷酮混合对照品中11种化学成分具有较好分离度的HPLC色谱图制备方法。
3.2 HPLC-PDA检测分析结果中,克感利咽口服液主成分色谱图中的主要色谱峰与对照品11个色谱峰相比,可以初步推断克感利咽口服液中主要药效物质含有绿原酸,栀子苷,黄芩苷,黄芩素。但在本实验条件下克感利咽口服液中仍存在少数的主要化学组成物质未能经鉴别出来。
3.3 不同生产批次克感利咽口服液中化学组成稳定,虽仅以10批产品为研究样品,但研究结果同样可适用于克感利咽口服液整个品种。
参考文献
[1] 顾丽贞, 李多娇, 刘征利, 等. 克感利咽口服液抗流感病毒及常见细菌的实验研究[J]. 中国中医药科技, 1998, 5(5): 303-305
[2] 刘凯, 李三鸣, 何媛, 等. HPLC法测定茵栀黄软胶囊中黄芩苷、栀子苷和绿原酸的含量[J]. 沈阳药科大学学报, 2005, 22(2): 122-125
[3] 闫永红, 段天璇, 王文全, 等. 野生及栽培甘草HPLC指纹图谱[J]. 中国天然药物, 2006, 4(2): 116-120
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作者单位:510055 广州市越秀区疾病预防控制中心�1
510006 广东药学院�2
