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[摘要] 目的：观察P16和Ki-67在正常外阴组织和不同级别外阴上皮内瘤变（VIN）中的表达结果，探讨二者在VIN中的意义。方法：收集74例外阴组织，其中，30例正常外阴组织，16例低级别VIN，28例高级别VIN，采用免疫组织化学Envision法进行标记，观察P16和Ki-67的表达情况。结果：正常组、低级别VIN和高级别VIN患者P16的阳性率分别是7%、44%、100%；Ki-67的阳性率分别为10%、75%、100%；P16和Ki-67在高级别VIN和正常组、高级别VIN和低级别VIN之间的阳性表达率差异均具有统计学意义（P＜0.01）。结论：P16和Ki-67在正常外阴上皮组织，低级别VIN，高级别VIN的表达有明显差异。采用二者联合标记，更能有效的降低假阳性病例的干扰，提高VIN诊断的特异性。
[关键词] P16；Ki-67；外阴上皮内肿瘤；免疫组织化学
[中图分类号] R737.35[文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2011）03（c）-０17－０3
Expression and significance of P16 and Ki-67 in differential diagnosis of high-grade and non-high-grade vulvar intraepithelial neoplasia
LI Yuhui
The People"s Hospital of Xiangxiang City, Hunan Province, Xiangxiang 411400, China
[Abstract] Objective: To correlate P16 expression and cellular proliferation measured by Ki-67 staining with the degree of vulvar intraepithelial neoplasia and to determine the efficacy of these markers in diagnosing high-grade vulvar intraepithelial neoplasia (VIN). Methods: 74 vulva specimens were studied including 30 normal/reactive lesions, 16 low-grade VIN (VIN I), and 28 high-grade VIN (VIN Ⅱ andⅢ). Immunostaining (Envision method) for P16 and Ki-67 was performed. Results: The positive percentages of P16 in normal/reactive lesions, low-grade VIN, high-grade VIN were 7%, 44%, 100% respectively. The positive percentages of Ki-67 in normal/reactive lesions, low-grade VIN, high-grade VIN were 10%, 75%, 100% respectively. The espressions of P16 and Ki-67 had significant differences between the high-grade VIN and on-high-grade VIN (P＜0.01). Conclusion: Both P16 and Ki-67 are reliable markers for diagnosing high-grade VIN.
[Key words] P16; Ki-67; Vulvar intraepithelial neoplasia; Immunohistochemistry
外阴上皮内瘤变（vulvar intraepithelial neoplasia,VIN）是指发生在外阴鳞状上皮内的一组不典型增生和癌前病变，可分为VINⅠ、VINⅡ、VINⅢ[1]。其中VINⅢ的复发率较高，38%的患者第一次治疗后会复发，15%~25%的患者可进展为浸润性鳞状细胞癌[2]。因此，准确的诊断出高级别VIN对患者的治疗和预后具有十分积极的意义。
长期以来对VIN的诊断主要依靠病理医生对组织切片的光镜观察，依靠医生的经验，诊断带有一定的主观性。同时由于取材的局限性，诊断误差较明显。P16和Ki-67已被发现可以鉴别较特异和敏感的不同级别CIN[3]和AIN[4]，但其在VIN临床应用价值中少有报道。本研究的目的在于观察P16和Ki-67在不同级别VIN中的表达，探讨其中VIN诊断中的临床意义。
1 材料与方法
1.1 材料
收集中南大学湘雅二医院病理科和本院病理科2005~2007年外阴活检标本和局剖手术切除标本共74例，所有标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋。VIN的病理分级按文献标准进行[5]，正常组30例，低级别VIN组（VINⅠ）16例，高级别VIN组（VINⅡ、Ⅲ）28例。
1.2 试剂
Ki-67兔单克隆体、P16鼠单克隆体均购于福州迈新生物技术公司：EnVision试剂盒为Dako公司产品。
1.3方法
免疫组织化学按SP法进行染色，具体操作按说明书进行。用AEC显色，光镜下控制显色时间，流水终止反应；常规脱水，水溶性封片。
1.4结果判断
Ki-67以细胞核出现红色颗粒状物为阳性着色；由于正常的鳞状上皮基底层细胞Ki-67呈阳性表达，实验仅观察基底层以上的上皮细胞的阳性率，并将阳性率分为＜10%为阴性病例；≥10%为阳性病例。同时按Ki-67阳性率10%~25%、25%~50%、＞50%3个级别进行统计分析。
P16以细胞质和（或）细胞核出现红色颗粒状物为阳性着色；P16免疫标记分为阴性，不连续的灶性阳性着色（且阳性细胞≤10%）和连续的弥漫的阳性着色（且阳性细胞＞10%）。
1.5 统计学分析
观察P16和Ki-67的阳性率和阳性表达方式，比较P16和Ki-67标记结果在高级别VIN与正常组，高级别VIN与低级别VIN组之间的关系，采用t检验，SPSS 10.0版统计软件包进行处理。同时确定P16和Ki-67作为高级别VIN标志物的特异性、敏感性。
2 结果
标本来源于74例女性患者，年龄19~65岁，其平均年龄45岁，中位年龄42岁。30例（41%）患者无外阴上皮内瘤变，16例（22%）患者是低级别VIN，28例（38%）患者是高级别VIN。
2.1 P16标记结果
见表1。
正常组外阴上皮93%（28/30）的病例P16无着色，仅有7%（2/30）的病例上皮呈局灶性的P16阳性着色，且阳性细胞均分布于鳞状上皮下1/3。未见中1/3和上1/3弥漫着色的病例。
低级别VIN44%（7/16）的病例P16呈现阳性，25%（4/16）的病例P16阳性染色阳性细胞位于上皮的下1/3，主要呈现灶性片状阳性着色；只有19%（3/16）呈现较弥漫着色（图1）。高级别VIN病例P16均呈阳性着色，93%（26/28）的高级别VIN病例P16阳性着色超过上皮1/3，主要呈弥漫阳性着色（图2）。P16的阳性表达率在高级别VIN与正常组，高级别VIN与低级别组之间差异均具有统计学意义（P＜0.01）。
2.2 Ki-67的标记结果
见表2。
正常组90%（27/30）的病例上皮Ki-67无着色，7%的病例上皮Ki-67阳性着色且阳性细胞分布于鳞状上皮的下1/3。3%（1/30）的病例上皮Ki-67阳性着色且阳性细胞分布于鳞状上皮的下1/3。3%（1/30）的病例上皮Ki-67阳性细胞分布于鳞状上皮的下1/3以上。
低级别VIN组，约有38%（6/16）的病例Ki-67阳性细胞大于25%，且阳性细胞分布于上皮下1/3以上（图3）。所有高级别VIN Ki-67均呈阳性，其中96%（27/28）的病例阳性细胞数大于25%，且分布到上皮中或上1/3（图4）。Ki-67的阳性表达率在高级别VIN与正常组，高级别VIN与低级别组之间差异均具有统计学意义（P＜0.01）。
注：P16阳性表达定义为中1/3和（或）上1/3上皮细胞的弥漫的阳性着色。Ki-67阳性表达定义为下1/3以上的上皮细胞大于或等于25%的细胞核阳性着色
通过对比高级别VIN与非高级别VIN的P16，Ki-67标记结果发现，若将P16阳性表达界定为中和（或）上1/3外阴上皮细胞弥漫阳性着色，Ki-67阳性界定为下1/3外阴上皮以上大于或等于25%的上皮细胞核阳性着色，P16和Ki-67在高级别VIN与非高级别VIN之间的表达存在显著性的差异（P＜0.01）。作为鉴别高级别VIN的标志物P16的敏感性、特异性分别是93%、94%，Ki-67的敏感性、特异性分别是93%、85%。
3讨论
研究证实外阴上皮内瘤变的病因机制与人类乳头状瘤样病毒（HPV）的感染有关[6]。HPV是一种无包膜的环状闭合双链DNA病毒，在鳞状上皮细胞层进行病毒复制，其所含有的E6、E7基因可整合入宿主的基因组内，E6通过泛素途径降解p53，E7引起Rb蛋白的功能失调。接着导致上皮细胞的细胞周期发生紊乱，引起包括Ki-67、P16蛋白在内的原本正常的细胞增殖蛋白出现异常表达[7]。
P16是一种抑癌基因[8]。当HPV感染的细胞PRb失活，使PRb负反馈调节细胞内P16水平的作用消失，P16表达增加。细胞增殖活性可通过检测Ki-67核抗原的表达水平进行评估，高危型HPV感染可导致上皮细胞增殖活跃。
本组实验数据结果显示，高级别VIN、低级别VIN和良性上皮中Ki-67的阳性率分别为100%、75%和10%；P16的阳性率分别是100%、44%和7%。可见P16和Ki-67在不同级别VIN中的显示均有较大的差异。另外，测试结果还显示高级别VIN上皮P16阳性细胞百分率高，主要呈弥漫阳性着色，阳性细胞分布于下1/3上皮以上，低级别VIN中P16阳性细胞少，主要呈灶性片状阳性，阳性细胞位于上皮的下1/3；Ki-67在高级别VIN中的阳性细胞分布于上皮中或上1/3，而低级别VIN病例Ki-67阳性细胞分布于上皮下1/3。采用P16和Ki-67标记外阴组织，可有效的鉴别正常组织、低级别上皮内瘤变与高级别上皮内瘤变[9]。
尽管这两种标志物均可有效的检出高级别VIN，但每种标志物的应用都有其局限性[10]。作为高级别VIN的标志物，P16的特异性为93%，比Ki-67高（87%）；敏感性为93%，比Ki-67稍低（96%）。本实验收集的30例正常患者中，有3例Ki-67呈阳性着色，其中2例阳性数小于25%，且细胞分布于上皮下1/3，根据高级别Ki-67阳性判断标准，这2例阳性患者应判断为阴性。余下的1例阳性数大于25%，且分布于上皮下1/3以上，且发现其真皮表面出较重的炎症反应，其原因可能是组织进行自主修复进而导致细胞增生活跃。因此，仅用Ki-67标记，并不能完全区别反应增生与上皮内瘤变。本组患者中，P16染色虽有3例表现为阳性着色，但阳性细胞均分布在上皮下1/3，根据P16阳性判断标准，此类病例判断为阴性着色，可见若Ki-67联合P16进行标记，可降低阳性的错判率，提高判断的准确性。我们在高级别VIN的判断标准中加入中1/3或上1/3上皮细胞的弥漫的阳性着色视为P16阳性，下1/3以上的上皮细胞大于或等于25%的细胞胞核阳性着色视为Ki-67阳性，提高了P16、Ki-67作为鉴别高级别VIN的特异性[11]。
对于VIN的常规病理组织学诊断，由于缺乏绝对的诊断标准，受主观因素影响较大，导致病理形态学诊断的可重复性相对较差。同时受送检标本上皮完整性，组织局限性等因素影响，出现VIN病理诊断时困难。而此类疾病无论是诊断不足或过诊断终导致疾病延迟治疗或过治疗。而P16，Ki-67检测为诊断提供了有效的客观参考指标，有助于提高诊断的准确性[12]。
本研究结果显示P16和Ki-67在外阴上皮正常组织、低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变之间的阳性表达率具有显著性差异，可敏感的鉴别出高级别VIN。采用P16和Ki-67二者联合标记，更能有效地降低假阳性病例的干扰，提高VIN诊断的特异性。
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（收稿日期：2011-01-07）
