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【摘要】 目的 测定Vitros950生化检测系统的最大稀释度。方法 对肌酐(CREA)、总胆红素(TBIL)、肌酸激酶(CK)、淀粉酶(AMYL)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)这8个项目的高值标本分别用生理盐水和低值患者血清进行不同程度的稀释，检测并计算预期值与实测值之间的误差，以美国CLIA’88能力验证计划的分析质量要求为标准判定结果是否可接受，以确定这8个项目分别用生理盐水和低值患者血清可以稀释的最大程度。结果 用低值患者血清稀释8个项目的最大稀释度均达到了1�∶�128；用生理盐水稀释，CREA的最大稀释度为1�∶�128，TBIL为1�∶�4，CK为1�∶�8，AMYL为1�∶�32，AST为1�∶�64，ALT为1�∶�16，TP为1�∶�4，ALB为10�∶�13。结论 生理盐水稀释患者血清作为临床检测较为方便，但是需要注意最大稀释倍数的限制。低值患者血清具有更理想的基质，能达到更大的稀释倍数。�
【关键词】最大稀释度；临床可报告范围；基质效应
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Determination of the maximum dilution in Vitros 950 biochemistry system
YAO Shao-yu，SUN Yan-hong，GAO Ling，et al.Department of Clinical Laboratory,1st Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China
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【Abstract】 Objective To investigate the maximum dilution of biochemistry analysis system of Vitros 950．Methods The samples were diluted separately with 0．9% NaCl or serum at low value of the items and then the analytes in the diluted samples were tested.The standard error were compared between two different dilutors and then the most suitable dilution rate were determined according to the standard of CLIA’88．Results The most suitable dilution of Crea,TBil,CK,Amy,AST,ALT,TP and ALB using serum at low value as dilutor reaches 1:128,while the most suitable dilution using 0．9% NaCl much lower.Conclusion Low value serum is more suitable as dilutor than 0．9% NaCl in Vitros 950 biochemistry system.�
【Key words】The maximum dilution；Clinical Reportable range；Matrix effect
从保证检验质量考虑，医学检验部门在使用检测系统进行患者标本检测前，除了有效的质量控制外，还必须要对使用的检测系统(即方法学，包括：仪器、试剂、方法、原理、校准品、检测程序等一体，以往也称为实验方法学)作严格的选择和评价，确定它的不精密度、不准确度、患者结果可报告范围、分析灵敏度、分析干扰和参考范围等分析性能。这些性能反映了检测系统的稳定状态和误差水平。在检测系统正式用于实际检测患者标本前，必须了解在检测系统最佳稳定状态下使用时的总(固有)误差水平。实验室只有使用总误差水平在临床上可接受的低水平的检测系统，才能真正使检验结果符合临床要求[1]。�
可报告范围(reportable range)指可以报告的所有结果范围，包含两种类型的范围，即分析测量范围(analytical measure range，AMR)和临床可报告范围(clinical reportable range，CRR)。�
分析测量范围(AMR)指对没有进行任何预处理(稀释/浓缩)的样本，分析方法能够直接测定出的待测物的范围，也就是系统最终的输出值(活性或浓度)与被分析物的活性或浓度成线性比例的范围，它反映整个系统的输出特性。�
临床可报告范围(CRR)是指对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。此范围如果超出了分析检测范围，可将样本通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，最后结果乘以稀释倍数[2]。�
日常工作中，经常会遇到样本的结果超过该分析项目的线性范围，在这种情况下，实验室操作员将样本进行稀释重做，再乘上稀释倍数，得出相应样本的结果。而样本稀释后由于基质效应等因素影响，检测结果必然产生误差[3]。欲知经稀释后的样本检测结果的误差是否在可接受范围内，则需要做样本的最大稀释度来确定。�
本次实验测定了Vitros950生化检测系统检测CREA、TBIL、CK、AMYL、AST、ALT、TP、ALB这八个检测项目分别用生理盐水和低值患者血清稀释所能达到的最大稀释度。�
1 材料和方法�
1．1 标本 均取自中山大学附属第一医院门诊患者新鲜血清。高值的标本均在此项目的最高线性范围附近，低值的样本血清均在此项目的最低线性范围附近。�
1．2 仪器 Vitros950全自动生化分析仪。�
1．3 试剂、标准品及质控品 均采用配套试剂及相应的标准品和质控品。�
1．4 方法�
1．4．1 选择在所检测项目的最高线性范围附近(包括最高范围)的高值标本和在此项目的最低线性范围附近(包括最低范围)的低值样本进行3次重复测定(非平行测定，而是分批测定)，取均值作为实验的100%真实结果。�
1．4．2 高值的患者样本以生理盐水按1�∶�2、1�∶�4、1�∶�8等比例稀释直至理想稀释度，测定结果。�
1．4．3 高值的患者样本以低值患者血清按1�∶�2、1�∶�4、1�∶�8等比例稀释直至理想稀释度，测定结果 。�
1．5 结果判断 计算各稀释度时实验样品内含分析物的浓度，为这些样品的预期值。计算预期值与实测值之间的误差。以美国CLIA’88能力验证计划的分析质量要求为标准判定结果是否可以接受[4]，见表1。
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2 结果�
2．1 根据厂家提供的分析项目的线性范围选择临床标本，见表2。
3 讨论�
Vitros 950全自动生化分析仪是由美国强生Johnson&Johnson公司生产的一种具有较高准确性及重复性的全自动干式生化分析仪，其采用了干片技术，替代传统的湿化学方法，以更方便快捷的方法进行生化实验。�
Vitros临床化学干片是一种干燥的、多涂层在透明的聚合物支撑基片上涂有测试性物质的干片。将适量样本滴于干片上，样本将均匀分布在分布层上并向下扩散(扩散层、试剂层、指示剂层、支持层)，在试剂层、指示剂层与相应试剂反应并显色，检测系统将自动检测并分析、报告结果。�
临床可报告范围(CRR)，即对临床诊断、治疗有意义的待测物浓度范围。当CCR超出了分析检测范围(AMR)时，可将样本通过稀释、浓缩等预处理使待测物浓度处于分析测量范围内，最后结果乘以稀释倍数[2]。日常工作中，也经常会遇到样本的结果超过试剂项目的线性范围，在这种情况下，实验室操作员将样本进行稀释重做，再乘上稀释倍数，得出相应样本的结果。而样本稀释后，处于分析物周围的非分析物浓度及成分的变化对分析物参与反应的强化或阻挠作用亦会有所变化，必然使样品测定结果引入误差，亦即基质效应[3]。欲知经稀释后的样本检测结果的误差是否在可接受范围内，则需要做样本的最大稀释度来确定。�
基质效应(matrix effect)按NCCLS文件的定义，指①标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响；②基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。广义说来，基质效应也应包括已知的干扰物(如Chol测定中胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等都是干扰物)，但目前只将基质效应限于生物材料中未知或未定性的物质或因素(如粘度、pH等)的影响。�
早在临床检验手工操作年代，人们经常发现有些检验项目的标准管与测定管的色泽和显色强度不一致，影响测定结果的准确性。这种现象在当时的血清胆红质测定过程中表现最为明显，因为那时所用的胆红质标准液常配制于有机溶剂(氯仿)中，与血清中的胆红质所处的介质环境不相同。分析物之间的相互干扰,血清钾钠的火焰光度计测定是一个典型例子。在血清钾钠的火焰光度计测定时，要用钾钠混合标准液，而且最好配制高中低几种浓度的混合标准液，这是因为标本中钠离子(浓度)能增强钾离子的激发光，这种效应称为相互激发，使能量从激发态的钠原子转移到钾原子，这些是人们对基质效应的早期认识。�
如今,基质效应对临床化学分析的影响越来越受到人们的重视。在酶法分析及免疫化学分析中普遍存在基质效应影响定量测定准确性的问题，从20世纪70年代开始尤其80年代末90年代初，国外许多专家学者致力于此方面的研究，探讨更多的是血脂和脂蛋白测定中基质效应问题。CHO测定已建立相当成熟的参考系统，有利于其基质效应的研究。�
可以说，基质效应是绝对的，只要两个样本间的基质状态不同，一定有基质效应。但基质效应又是相对的，只要认为某一检测系统的基质效应可被忽略不计，或者由基体效应对某检测系统引入的误差在可接受的水平，可认为“无”基体效应[2]。因此，本研究除了选择了实验室日常工作中最常使用的生理盐水进行稀释，同时还选择了拥有理想基质的混合低值患者血清标本来进行稀释，并以美国CLIA’88能力验证计划的分析质量要求为标准判定结果。�
根据美国CLIA’88能力验证计划的分析质量要求，若检测系统稳定状态误差水平正好等于或稍小于总误差水平，即可认为该检测系统的稳定误差属于可接受水平，可以用于常规条件下对患者样品的检测。美国临床实验室管理法规对评估室间质量的指标，是最低质量要求，如果连这样低的指标都不能实现，那么临床实验室无法接受患者样品进行检测。�
本次实验测定了肌酐(CREA)、总胆红素(TBIL)、肌酸激酶(CK)、淀粉酶(AMYL)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)这8个项目分别用生理盐水和低值患者标本稀释所能达到的最大稀释度。为确保结果的准确性，在实验前必须对将检测的系统进行校准，并根据各个检测项目方法的要求完成质控，始终保持仪器处于良好的质量控制状态。实验中必须准确加样，减小人为误差影响实验结果。�
在选择标本的时候，高值的标本必须在此项目的最高线性范围附近(包括最高范围)，低值的样本血清必须在此项目的最低线性附近(包括最低范围)，样本的类型最好来自于门诊的样本，尽量避免药物的干扰。比较理想的是用新鲜的血清(2 h内)进行检测，但是必要时可以使用冷冻的标本，但要考虑到每个项目的样本保存条件，且不要使用对任何检测方法有干扰的样品，如溶血、脂血、黄疸等。�
从实验结果可以看出，用低值血清稀释可以得到很满意的结果，而用生理盐水稀释所能达到的最大稀释度远远不如用低值患者血清稀释所达到的最大稀释度。用低值患者血清稀释时，所检测的8个项目在稀释度为1�∶�128时，测量误差仍在美国CLIA’88能力验证计划的分析质量要求的可允许误差范围内。虽然可能还能达到更大的稀释度，但是如果继续更高倍数稀释，预期值已与低值标本十分接近，且根据经验认为已可满足临床需要，因此没有进行更高倍数的稀释。而用生理盐水稀释的项目中，只有CREA的稀释度达到了1�∶�128，且整体来说各个稀释度时的误差都比用低值患者标本稀释时大。这充分证明了基质效应的影响，但CREA在1�∶�128稀释度时的测量误差仍在可允许误差范围内，说明Vitros950生化检测系统检测CREA时受基质效应的影响不大。�
本次实验中用生理盐水1�∶�4稀释总蛋白时，误差为2．8%(可允许误差：10%)，然而Vitros950生化检测系统检测总蛋白的线性范围为20~110 g/L，若作1�∶�8稀释，预期值已低于其线性下限。因此，1�∶�4已经是用生理盐水稀释总蛋白的理想稀释度，未作更高倍数的稀释。同样，用生理盐水1�∶�32稀释淀粉酶时，误差为11．1%(可允许误差：30%),然而Vitros950生化检测系统检测淀粉酶的线性范围为30~1200 U/L，若作1�∶�64稀释，预期值低于其线性下限，1�∶�32已是用生理盐水稀释淀粉酶的理想稀释度，亦未作更高倍数的稀释。�
本次实验中用低值患者血清稀释白蛋白，稀释度为1�∶�128时测量误差仍在美国CLIA’88能力验证计划的分析质量要求的可允许误差范围内，而用生理盐水10�∶�14稀释时，误差即已达到了15．9%，远远超出其可允许误差范围(10%)。原因除了基质效应外，还与Vitros干片的结构原理有关。Vitros临床化学干片是一种干燥的、多涂层的，在透明的聚合物支撑基片上涂有测试性物质的干片。分析仪将精确测量的样本量加于干片上。Vitros干片的最顶层是扩散层(每种类型的干片通用)，扩散层是一个多孔层，它可将样本均匀地分布到整个干片区，在允许样本透过它渗透到其它层的同时滤出干扰化学反应的较大分子(如蛋白、脂肪、血红蛋白)。在试剂层与试剂层中含有的酶、缓冲剂和催化剂发生化学反应。指示剂层含有一种染料或类似指示剂，以生成一种有色复合物。当试剂层产物与指示剂层中的染料结合时，会形成有色复合物。有色复合物的量与分析物浓度成正比。分析仪将通过透明的支持层自动检测并分析、报告结果。用生理盐水稀释白蛋白时，由于稀释后的血清渗透压改变，影响了白蛋白的均匀分布及向下扩散，导致结果产生较大误差。因此白蛋白只能以较低倍数稀释。而用低值患者血清稀释时，由于两个标本的组成基本相同，以较高倍数稀释时渗透压的变化也不大，几乎不影响白蛋白的均匀分布和向下扩散，因此可以稀释较高倍数。�
在实验过程中发现少数标本在检验Cr过程中出现“OR”(Out-side Range)和“DP”(Substrate Depletion)报警，提示标本中Cr“超过”检测范围，经稀释处理后发现检测结果实际上并未超出检测线性范围(40~1238)。Vitros方法学手册中提到，Vitros950检测Cr时，先使CREA分解为肌酸，再将肌酸继续分解为肌氨酸，最后发生显色反应，因此当肌酸浓度达到一定程度时，即有可能引起底物耗竭而出现“OR”(out-side range)和“DP”(substrate depletion)报警。将报警标本稀释后，肌酸浓度下降，CREA浓度即可测出。通过病例分析及相关资料检索发现，异常报警多出现于心肌梗死患者，这是由于发生急性心肌梗死后，小相对分子量的肌酸从损伤梗死部位的心肌细胞中大量释放，很快到达全身循环，导致外周血中肌酸浓度短暂升高[5,6]，从而Vitros950的CREA检测产生干扰。已有相关研究证实当Cr浓度为230．5 mg/L、肌酸浓度>60 mg/L时，结果就会出现“OR”和“DP”报警[7]。�
日常工作中，不同的检测系统都会遇到样本的结果超过测试项目的线性范围。本研究在Vitros系统上确定了CREA、TBIL、CK、AMYL、AST、ALT、TP、ALB这八个项目利用生理盐水稀释的最大稀释倍数，而利用低值患者血清进行稀释则能达到更大的稀释倍数，具有较高的实际应用价值。�
参考文献
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［4］ Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988.�
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［7］ 张心菊，吴炯，郭玮，等．强生Vitros950生化检测系统性能验证．检验医学，2006，21(6).�
