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【摘要】 目的 探讨丹参中丹参酮ⅡA的最佳醇提取工艺条件,为丹参药材的综合利用提供实验依据。方法 采用正交试验法,以丹参酮ⅡA的提取量及浸膏得率为考察指标,优选回流法提取的最佳工艺条件。结果 最佳乙醇回流工艺为:用 95% 的乙醇提取两次,第一次用6倍量的乙醇提取1 h,第二次用 4 倍量的乙醇提0.5 h。结论 优选的提取工艺设计合理,丹参酮ⅡA提取率较高,试验重现性好。
【关键词】 丹参;丹参酮ⅡA;提取;工艺
Study on extract process of tanshinone ⅡAinSalvia miltiorrhizabge
LI Wei,CHEN Xing.Second People’s Hospital of Yueyang,Yueyang Hunan 414000,China
【Abstract】 Objective To develop comprehensive utilization of Salvia miltiorrhiza to explore the best conditions of extract Tanshinone ⅡA in Salvia miltiorrhizaBgeby ethanol.Methods With tanshinone ⅡA and Yield of extract as index, optimization of reflux to the optimum conditions.Results The optimal refluxing was to extract twice with 95% alcohol.The first time was 6 fold amount alcohol and 1 hour extracted for1.0 h,The second time was 4 fold amount alcohol and extracted for half hour.Conclusion Optimization extraction process design is reasonable, extraction rate of Tanshinone Ⅱ is higher,and trial is Reproducible.
【Key words】 Salvia miltiorrhizabge; Tanshinone ⅡA;Extract;Technology
丹参为唇形科植物丹参 (Salvia miltiorrhizaBge)的干燥根及根茎,味苦,性微寒。具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦功效[1]。其化学成分主要分为为脂溶性和水溶性两大类。脂溶性成分主要包含以下物质:丹参酮 I、 丹参酮 ⅡA、丹参酮ⅡB、丹参酮 V、丹参酮 Ⅵ等;具有天然抗氧化活性、天然心血管药理作用以及抗菌消炎作用, 还具有明显的抗肿瘤作用。水溶性成分主要为:丹参酸甲也称丹参素、D(+) 3 - 1 3 , 4二羟基苯乳酸 J 、丹参酸乙、丹参酸丙、 琥泊酸 、 丹参酚酸 A、 丹酚酸 B 等[2],对水溶性成分这一部分研究较多。笔者以丹参酮ⅡA为代表对丹参中的脂溶性成分进行提取工艺研究,以获取最佳提取工艺条件,为丹参的综合利用奠定基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪:手动进样器、二极管阵列检测器(DAD),AR2140型电子分析天平(Ohaus Corps,USA):感量0.1 mg。
1.2 试剂与试药
丹参酮I I A ( 批号:100081-200406) 标准品购自中国药品物制品检定所;丹参药材购自湖南振兴中药饮片有限公司,经鉴定为丹参Salviamiltiorrhiza Bge的根;甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil-C18柱(200 mm ×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(80�20);柱温:25 ℃;检测器:二极管阵列检测器(DAD);检测波长:270 nm;流量:1.0 ml/min。理论塔板数按丹参酮I I A计算不少于3500,分离度大于1.5。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取丹参酮ⅡA 2 mg置10 ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得对照品储备液。
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作者单位:414000湖南省岳阳市二人民医院(李伟);岳阳市一人民医院(陈兴)
精密吸取储备液1 ml置10 ml量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度, 即得(每1 ml含丹参酮ⅡA 20 μg)。
2.3 供试品溶液的制备 取丹参粉末约1 g(过三号筛),精密称定,按正交各试验条件回流提取2次,合并两次提取液,定容,摇匀,过0.45 μm 的微孔滤膜,备用。
2.4 测定方法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl注入液相色谱仪,测定供试品中丹参酮ⅡA的提取量。
2.5 干膏率测定 精密量取25 ml的醇提液, 置于已干燥恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后, 于105℃干燥3 h,移于干燥器中冷却30 min,迅速精密称定重量,计算干膏收率,干膏收率(%)=干膏重量/丹参重量×100%。
2.6 数据处理
根据所选指标进行多指标综合评分,以各组指标中的最大值为参照将数据进行归一化,分别给出权重系数。丹参酮IIA提取量和浸膏得率的权重系数分别为0.70、0.30,并计算出综合评分进行统计分析。
综合评分=(各样品中丹参酮IIA提取量/该组中丹参酮IIA最大提取量)×0.70×100+(各样品浸膏得率/该组中最大浸膏得率)×0.30×100
2.7 提取工艺条件考察
2.7.1 正交试验 根据预试结果与文献[3,5],对影响丹参酮IIA提取量较大的几个因素:乙醇浓度、提取时间、溶剂倍数进行正交试验设计,每个因素取3 水平设计因素水平表,以丹参酮IIA 提取量及干膏收率为评价指标筛选最佳提取工艺。采用L9(34)正交试验表安排试验。因素水平表见表1。试验结果见表2。方差分析见表3。
表1
正交实验因素水平表
水平因素
乙醇浓度(A)(%)提取时间(B)(h)乙醇用量(倍)
1651.0;0.56;4
2801.5;1.08;6
3952.0;1.510;8
表2
正交试验设计表及结果(n=3)
试验号因素结果
ABCD浸膏得率(%)丹参酮IIA 提取量(mg)综合评分
1111118.032.1559.07
2122220.712.2764.13
3133322.112.4168.21
4212324.722.9881.59
5223123.522.5672.49
6231221.492.3366.07
7313226.873.1386.65
8321325.283.0783.86
9332128.563.75100
K1191.41227.31209231.56
K2220.15220.48245.72216.85
K3270.51234.28227.35233.66
R79.113.836.7216.81
表3
方差分析表
方差来源离均差平方和(ss)自由度(d•f)均方(MS)F值显著性(p)
A1068.772534.3819.11P0.05
C224.732112.364.02 P>0.05
D(误差)(error)55.93227.97
2.7.2 方差分析 从直观分析可以看出影响工艺因素大小的次序依次是A>C>B,A因素为主要影响因素,B、C因素次之,因素最优水平组合为A3B3C2。从方差分析结果可以看出A因素影响具有显著性差异,而B、C两因素无显著性影响。从缩短生产周期及节约能源方面考虑,B因素取B1水平,C因素取C1水平,最优组合为A3B1C1,即用95%的乙醇提取两次,第一次用 6 倍量的乙醇提取 1 h,第二次用4 倍量乙醇提取0.5 h。
2.7.3 验证试验 取试药约1 g,精密称定,按照A3B1C1进行验证,结果见表4。
表4
验证实验结果
编号(No.)浸膏得率(%)丹参酮IIA 提取量(mg)
127.873.75
228.363.70
327.653.83
平均值(average)27.963.77
RSD(%)1.302.03
3 讨论与结语
通过正交L9(34)实验,确定最佳乙醇回流工艺为:用95%的乙醇提取2次,第一次用6倍量的乙醇提取1 h,第二次用4倍量的乙醇提取0.5 h。其结果经验证确认该条件可行,为进一步开发丹参提供科学依据,具有良好的现实意义。丹参的脂溶性大多为共轭醌、酮类化合物,具有特征的橙黄色和橙红色。其中酮类具有显著的抑制白介素-2p40基因的mRNA水平的表达,而且丹参酮类强有力抑制白介素-12p40基因和卡巴粒链联的促进剂活性,且在转泵水平不调整白介素-12产物,即提示丹参酮的抗炎作用[6]。丹参是一传统中药,应用历史悠久,对其化学成分研究比较透切。由于丹参酮IIA不稳定,易发生降解反应,在制剂中难以控制其量。在预试中发现,提取时间越长,乙醇浓度越高,提取液的颜色由淡黄色逐渐变为橙红色。
参 考 文 献
[1] 国家药典委员会.中国药典(一部).化学工业出版社,2005:52-53.
[2] 徐丽君,黄光英.丹参的化学成分及其药理作用研究概述.中西医结合研究,2009,1(1):45-48.
[3] 韩晓珂,刘汉清,张明,等,渗漉法和回流法提取丹参药渣中脂溶性成分的比较研究.现代中药研究与实践,2009,23(1):61-63.
[4] 韦敏,张静华.渗漉法提取丹参脂溶性部位的工艺研究.时珍国医国药,2009,20(2):422-423.
[5] 王猛,孙妍.正交试验法考察丹参酮ⅡA的提取工艺.黑龙江中医药,2(2):50-52.
[6] 孙吉兰,常云亭,宋海英,等.丹参的体外抑菌作用研究.时珍国医国药,2003,14(12):725.
