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[摘要] 目的：建立虾中9种磺胺类抗生素残留的高效液相色谱-串联质谱同时测定方法。方法：样品经乙腈提取，经脱脂、净化、浓缩后，以A相为甲醇、B相0.50 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，采用HPLC-MS/MS多反应监测（MRM）正离子模式测定。结果：9种磺胺类药物在0～100 ng/ml范围内线性关系良好（γ>0.999 0），加标回收率为75.3%～95.6%，相对标准偏差（RSD）为4.5%～13.5%。结论：该方法准确、可靠、灵敏度好，适用于磺胺类药物残留的检测。
[关键词] 高效液相色谱-质谱法；磺胺；药物残留；虾
[中图分类号] R92[文献标识码] C[文章编号] 1674-4721（2011）08（b）-060-03
Simultaneous determination of 9 sulfonamides residues in shrimps by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
BAI Lili1, DAI Hua2, LIN Zhengfeng3
1.Department of Pharmacy, Hainan Medical University, Hainan Province, Haikou 571101, China; 2.School of Public Health, Hainan Medical University, Hainan Province, Haikou 571101, China; 3.Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hainan Province, Haikou 570311, China
[Abstract] Objective: To develop the method for the simultaneous determination of 9 sulfonamides (SAs) residues in shrimps by high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Methods: The sample was extracted with acetonitrile, defatted and purified and then concentrated by evaporation. The 9 analytes were separated with a mobile phase composed of methanol and 0.50 mmol/L aqueous ammonium acetate solution. The mass spectrometer was operated using multiple reaction monitoring (MRM). Results: The 9 drugs showed good linear correlation in the range of 0-100 ng/ml (γ>0.999 0). The average recovery rate was 75.3% to 95.6% at two concentration levels. The relative standard deviation was 4.5% to 13.5%. Conclusion: The results indicate that the HPLC-MS/MS assay is accurate, reliable, and sensitive, thus it is suitable for the determination of SAs in aquatic products.
[Key words] High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); Sulfonamides; Drug residue; Shrimp
磺胺类药物（SAs）是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是常用的广谱抗生素。因其具有抗菌谱广、高效、低毒和价格低廉等特点，在水产养殖中被广泛使用。人类经常食用有磺胺类药物残留的动物源性食品，就可能引起磺胺类药物在体内的逐渐累积，其危害性主要表现为细菌耐药性、过敏、造血紊乱、致癌作用以及激素样作用等[1-2]。目前中国、欧盟、美国、日本等均将磺胺类药物列为动物饲养过程中限制使用的药物，其最大残余限量一般为50～100 μg/kg。目前，用于抗生素的检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、酶联免疫分析法（ELISA）、气相色谱法（GC）、高效毛细管电泳法（HPCE）、液相色谱-质谱法（HPLC-MS/MS）等方法[3-5]。本文采用高效液相色谱-质谱法，建立检测虾中9种磺胺类药物残留的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
液相色谱仪（配有四元泵，Agilent公司），质谱检测器（API3000，AB公司），液相色谱柱（菲罗门Gemini C18，5 μm，4.6×150 mm），组织捣碎机，电子分析天平（感量为0.01 g，上海梅特勒公司），涡旋混合器（德国IKA公司），超声波清洗机，冷冻离心机（SIGMA公司），0.45 m有机微孔滤膜。乙腈、甲醇、异丙醇、正己烷和醋酸铵为色谱纯（美国TEDIA公司）；无水硫酸钠（经650℃灼烧4 h，置于干燥器皿内备用）为分析纯；水为去离子水。磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉和磺胺甲恶唑均来自于德国Dr.公司。
标准储备液的配制（400 μg/ml）：分别准确称取磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉和磺胺甲恶唑10.0 mg（准确至0.1 mg），置于25 ml容量瓶，用少量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，混匀，浓度为400 μg/ml浓度，置于4℃冷藏避光保存。
混合标准储备液：分别准确量取1.000 ml 9种磺胺类药物标准储备液，用甲醇定容至100 ml，浓度为40 μg/ml的标准中间液，置于4℃冷藏避光保存。
1.2 样品前处理
1.2.1 制样虾：去头、去壳，取可食肌肉部分，经组织捣碎机充分匀浆。
1.2.2 提取与净化准确称取样品5.00 g于50 ml离心管中，加入约10 g无水硫酸钠，涡旋混匀；加入20 ml乙腈提取液，涡旋混匀2 min；4 000 rpm离心5 min，取上层清液，再次加入10 ml乙腈提取液，涡旋混匀2 min；4 000 rpm离心5 min，合并上层清液，加入2 ml异丙醇，于40℃水浴下旋转蒸发至干。准确加入1.00 ml乙腈+水（10∶90），涡旋后再加入0.5 ml正己烷涡旋，转移入1.5 ml离心管，15 000 rmp离心5 min，取下层溶液过0.45 μm有机滤膜到进样瓶中，供液相色谱-质谱仪测定。
1.3 分析条件
1.3.1 色谱条件色谱柱：菲罗门Gemini C18，5 μm，4.6×150 mm或相当者；进样量：50 μl；柱温：30 ℃；流动相：A相为乙腈、B相0.50 mmol/L醋酸铵溶液；流速：0.80 ml/min；梯度洗脱条件见表1。
1.3.2 质谱条件大气电喷雾离子源ESI，正离子模式；多反应监测（MRM）；离子源喷雾器电压（IS）：5 500 V；离子源温度：450℃；帘气0.4 MPa、雾化气0.6 MPa、辅助加热气0.7 MPa、碰撞气0.4 MPa均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。
2 结果与讨论
2.1 结果
2.1.1 线性关系配制浓度为0.0、5.0、12.5、25.0、50.0、100.0 ng/ml的标准溶液，按设定色谱条件进行线性分析，以溶液浓度（ng/ml）为X，对峰面积为Y绘制标准工作曲线。结果表明，各种化合物的质量浓度在0～100 ng/ml范围内线性良好，相关系数均大于0.999 0。
2.1.2 检出限与定量限在 5 μg/kg添加水平时，各药物峰的信噪比均大于3，故将其定为检出限。在 10 μg/kg添加水平时，各药物峰的信噪比均大于10，且回收率、相对标准偏差（RSD）满足条件，故将其定为定量限。
2.1.3 添加回收率的验证以阴性虾为基质，分别向其中加入5 μg/kg和10 μg/kg浓度的磺胺类药物混合标准溶液，进行提取、净化及色谱分析。每个添加水平作 6份平行测定，结果表明：平均回收率为75.3%～95.6%；相对标准偏差为4.5%～13.5%；结果见表2。
2.2 讨论
2.2.1 提取条件以乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷作为提取剂，在同一添加水平和相同试验条件下：经乙酸乙酯提取检测时发现磺胺嘧啶、磺胺喹恶唑等回收率低，且提取液也将样品中大量脂肪带入，使净化难。二氯甲烷提取液浑浊，净化难度大。乙腈提取效率最高，脂肪带入少，易净化，但是由于样品组织中水较多，导致浓缩效率低，因此在加入乙腈前，先加入无水硫酸钠除水。为使其蒸发效率加快，加入异丙醇可使乙腈旋转蒸发时避免爆沸，在定容后再加少量正己烷除去剩余脂肪[6-7]。
2.2.2 流动相的选择流动相的pH值对 SAs的分离和保留具有显著的影响[7]。实验比较了不同浓度的甲醇乙酸、甲酸与乙腈配比梯度洗脱，比较发现乙腈、0.50 mmol/L醋酸铵溶液为流动相，可以保证理想的分离度，同时配上合适的梯度淋洗条件，较好地实现了SAs的分离，9种磺胺类药物均能达到基线分离，峰形尖锐，峰对称性好。
2.2.3 质谱条件的优化根据磺胺药物的分子结构，实验表明：磺胺在离子源 ESI+电离方式下，通过全扫描确定[M+H]+离子峰，分别以此为母离子进行二级质谱分析，找出二级质谱中两个信号最强的碎片离子，以母离子和子离子组成监测离子对，见表2。以MRM 的方式对样品进行定性和定量分析，如图1所示。
Fig.1 Totalion current chromatograms of mixed 9 sulfonamide standards
注：1.SD；2.SCP；3.SMP；4.SDD；5.SMZ；6.SMM；7.SDD；8.SQX；9.SDM
3 结论
本方法以乙腈-0.50 mmol/L醋酸铵溶液为流动相，采用离子源ESI+；多反应监测（MRM）检测模式，建立了虾中9种磺胺类药物残留的HPLC-MS/MS测定方法。方法准确、可靠，且方法的定量限达到5 μg/kg以下，有极高的检测灵敏度，满足于低含量样品的测定，在本地区水产品的进出口检验检疫中得到很好的应用。
[参考文献]
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[6]李佐卿,倪梅林,俞雪钧,等.液相色谱-串联质谱法检测水产品中磺胺类和喹诺酮类药物残留[J].分析测试学报,2007,26(4):508-510.
[7]蒋施,赵颖,金雁,等.超高效液相色谱-串联质谱法测定动物组织中19种兽药残留量[J].理化检验-化学分册,2010,46(11):1319-1322.
（收稿日期：2011-07-04）
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