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【摘要】 目的 扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A9(melanoma antigen A9) cDNA ,构建原核表达载体,制备抗MAGE-A9单抗，观察其在肝细胞癌中的定位。方法 从人肝癌组织提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A9 cDNA,插入载体pMD18-T中，测序正确后,构建重组表达载体pBAD/gIII-MAGE-A9,转化大肠杆菌TOP10株进行表达。重组蛋白经L-Arabinose诱导表达纯化后，制备抗MAGE-A9单抗，免疫组化检测MAGE-A9在肝细胞癌中的表达和定位。结果 获得AGE-A9cDNA,测序结果与GenBank一致。成功构建表达载体,表达可溶重组蛋白，SDS-PAGE分析其相对分子质量为35 Kd。获得抗MAGE-A9单抗，MAGE-A9在肝细胞癌中的阳性表达率为21%�（8/39）�,主要表达于胞浆,未见肿瘤异质性，统计学分析MAGE-A9的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性。结论 有相当部分肝癌患者的肿瘤表达MAGE-A9抗原，且其表达与患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性，MAGE-A9可能成为肝癌特异性免疫治疗的靶点。
【关键词】 黑色素瘤抗原；MAGE-A9；RT-PCR；基因克隆；基因表达
Construction of MAGE-A9 gene prokaryotic expression system and its expression in hepatocellular carcinoma
XU Lu，ZHU Jin，QIU Zhen-ning, et al. Department of Pathology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China
【Abstract】
Objective It�s to clone human MAGE-A9 cDNA ，to express its recombinant protein in E. coli and to examine the expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens.Methods The cDNA encoding human MAGE-A9 gene was amplified by RT-PCR from human hepatocelluar carcinoma tissue before the MAGE-A9 gene was inserted into plasmids pMD18-T. After sequencing, the MAGE-A9 was cloned into the prokaryotic expression vector pBAD/gIII to construct the recombinant expression vector pBAD/gIII-MAGE-A9 and was transformed into E. coli TOP10．The recombinant MAGE-A9 protein was expressed under induction of L-Arabinose and was purified through Hitrap column. The anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was generated. The expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens was examined through ABC assay.Results The sequence of MAGE-A9 was identical to the sequence from GenBank. By affinity column and SDS-PAGE , the purified MAGE-A9 fusion protein displayed a band of Mr 35 000． Anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was procuced. We found that MAGE-A9 expressed in the cytoplast of positive cells and MAGE-A9 antigen was detected on 8 cases out of 39 (21%) hepatocellular carcinoma specimens.Conclusion MAGE-A9 antigen was expressed in a fair proportion of hepatocellular carcinoma specimens , these patients might be suitable candidates for immune involving antigen encoded by MAGE-A9 gene.
【Key words】 Melanoma antigen ; MAGE-A9; RT-PCR; Gene cloning; Gene expression
MAGE-A（melanoma antigen A）基因是首先从黑色素瘤中发现的一组肿瘤相关抗原，这类抗原在正常组织中除睾丸和胎盘组织外均不表达,但在某些恶性肿瘤组织高度特异性表达,同时它们经MHC-Ⅰ类分子递呈到细胞表面后,可为自体细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 识别［1］,因
而是一种CTL介导的特异性免疫治疗的理想靶分
子［2］。迄今已知MAGE-A基因家族成员达12个，各成员间的同源性较高。而肝细胞癌在我国发病率高，临床疗效及预后均很不理想，近来针对肝细胞癌的免疫治疗成为研究热点。
MAGE-1A9 cDNA 全长945 bp,编码分子量约�35 Kd�的蛋白产物。本文通过克隆、表达肝细胞癌MAGE-A9基因，制备抗MAGE-A9的单克隆抗体，观察MAGE-A9基因在肝细胞癌中的表达及定位，为进一步进行MAGE-A9基因的功能研究及肝细胞癌的免疫治疗奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料 6～8周龄雌性BALB/c小鼠，购自南京医科大学动物中心。肝细胞癌手术切除新鲜标本1例，取自江苏省肿瘤医院住院患者，液氮保存。肝细胞癌蜡块标本39例，其中38例取自南京医科大学第一附属医院病理科，1例取自江苏省肿瘤医院病理科，男性共36例，女性3例，年龄31～74岁。大肠杆菌菌株TG1及Top10由本实验室保存。质粒pMD18-T购自大连宝生物公司，pBAD/gIII 载体购自美国Invitrogen公司。PCR试剂，ExTaq酶，限制性内切酶EcoR I、Hind III, T4 DNA连接酶,等购自大连宝生物公司； Hitrap镍亲合柱购自美国Amersham公司； ABC免疫组化试剂盒购自美国Vector公司。
1．2 方法
1．2．1 引物设计与合成 根据GenBank中MAGE-A9基因序列设计引物P1：5�CACAAGCTTCGGACTCC CTCTTCCTCCTCTCT 3�；P2：5�CCGGAATTCGAATGT CTCTTGAGCAGAGGAGT 3�，分别引入Hind III 和EcoR I酶切位点,由北京赛百盛公司合成。
1．2．2 肝癌组织总RNA制备及RT-PCR扩增 Trizol一步法提取肝癌组织总RNA，将抽提产物溶于DEPC处理的双蒸水中，以P1和P2为引物作RT-PCR扩增:94 ℃ 4 min预变性，94 ℃ 50 s变性，58 ℃ 50 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共30个循环，72 ℃终末延伸7 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1．2．3 MAGE-A9基因的克隆 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化, 将纯化的PCR产物与pMD18-T载体进行T-A克隆重组, 连接产物转化感受态大肠杆菌TG1,蓝白斑筛选阳性克隆, PCR初步鉴定阳性克隆后,进行DNA 序列分析。碱裂解法提取阳性重组体pMD18-T- MAGE-A9质粒, 用EcoR I、 Hind III 酶切, 酶切产物与同样酶切的表达载体pBAD/gIII用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化感受态大肠杆菌TG1,氨苄平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒,以EcoR I、Hind III 酶切, 1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定阳性克隆,所得重组质粒命名为pBAD/gIII-MAGE-A9。
1．2．4 MAGE-A9基因的诱导表达及纯化 取1μl质粒pBAD/gIII-M9转化感受态大肠杆菌Top10, 氨苄平板筛选. 挑取单个阳性克隆培养至A600 nm=0．5,加入左旋阿拉伯糖(终浓度为0．002%)，于37 ℃
剧烈震荡诱导表达4 h后收菌,PBS 重悬,超声裂解,低温离心,取上清。表达产物经超声破碎,离心，上清经Hitrap镍亲和柱吸附, 样品过柱, 以含有0．2、0．3、0．4和0．5 M咪唑的洗脱液依次洗柱，收集纯化液, 行12％SDS-PAGE电泳，分析最佳的咪唑洗脱浓度。
1．2．5 单抗制备 常规杂交瘤法制备单抗。腹腔注射100 μg MAGE-A9蛋白纯化产物免疫BALB/c小鼠，对数生长期的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞和免疫小鼠的脾细胞按常规PEG方法融合,有限稀释法克隆细胞。ELISA法检测杂交瘤培养上清,阳性细胞连续亚克隆,直至阳性率达到100%，确定为稳定的细胞株。
1．2．6 免疫组化 肝细胞癌石蜡切片4～5 μm，常规乙醇脱蜡至水，0．01%柠檬酸盐缓冲液微波修复，3%H�2O�2阻断内源性过氧化物酶，2%二抗动物（马）血清封闭,以本实验制备的抗MAGE-A9杂交瘤细胞培养上清为一抗，常规ABC法染色，DAB显色。以PBS代替一抗作为空白对照。
2 结果
2．1 RT-PCR扩增MAGE-A9基因 采用RT-PCR从人肝细胞癌组织中扩增目的基因,产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大小约945 bp 的条带，见图1,与�945 bp�的MAGE-A9基因目的片段大小一致。
注：1:MAGE-A9;2:DL2 000 Marker
图1
MAGE-A9基因RT-PCR扩增结果
2．2 MAGE-A9基因克隆载体的构建 将PCR产物与pMD18-T载体进行T-A克隆，获得pMD18-T-MAGE-A9重组体，见图2，经蓝／白斑筛选和菌液PCR初步鉴定结果正确。DNA 序列分析表明质粒为MAGE-A9基因的克隆,序列与GenBank 报道序列完全一致。MAGE-A9基因与原核分泌型表达载体pBAD/gIII经EcoR I＋Hind III双酶切后连接，构建MAGE-A9基因的原核分泌型表达系统pBAD/gIII-MAGE-A9。
注：1: DL15 000 Marker; 2: DL2 000 Marker;3: pMD18-T-MAGE-A9;4: pBAD/gIII-MAGE-A9
图2
pMD18-T-MAGE-A9及pBAD/gIII-MAGE-A9重组质粒酶切鉴定图谱
2．3 MAGE-A9 蛋白的诱导表达和纯化 菌体经左旋阿拉伯糖诱导，冰冻超声裂解离心后，取上清行SDS-PAGE，结果见图3，与空载菌对比，在分子量约35 Kd的位置有明显表达条带，符合MAGE-A9基因945 bp片段编码315个氨基酸的蛋白分子质量。用HiTrap镍亲和柱纯化带有(His)6尾的重组蛋白，洗脱液咪唑浓度从0．2～0．5 M，纯化液行12％SDS-PAGE电泳。洗脱最佳咪唑浓度为0．4 M。
注：1-4:纯化的MAGE-A9（纯化咪唑浓度从0．2~0．5 M）；5:Marker；6:空载细菌；7:诱导表达的菌体蛋白
图3
SDS-PAGE 鉴定MAGE-A9蛋白的表达和纯化
2．4 抗MAGE-A9单克隆抗体的制备和鉴定 间接ELISA法检测杂交瘤培养上清，经3次亚克隆，阳性率达100%。Western blot法检测单抗与MAGE-A9的结合，结果 见图4。
注：1：细菌空载； 2:MAGE-A9 protein;3: Marker
图4
Western blotting 鉴定MAGE-A9 单抗
2．5 MAGE-A9在肝癌组织的定位观察 阳性表达表现为癌细胞胞浆被染成棕红色 见图5，非癌肝细胞未着色。39例肝细胞癌，阳性表达8例，阴性31例，阳性表达率为21%。MAGE-A9基因的表达与部分临床指标的关系见表1。
注：左图为阳性癌细胞胞浆染成棕褐色，右图为非肝癌细胞未着色
图5
肝细胞癌MAGE-A9基因表达产物定位观察。（DAB显色， 400×）
注：采用u检验进行统计学分析,P>0．05;MAGE-A9的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度无相关性
3 讨论
寻找合适的肿瘤抗原一直是肿瘤免疫治疗的难题。自20世纪50年代以来，科研工作者陆续在以黑色素瘤为主的多种肿瘤中发现了一些肿瘤相关抗原，从而成为肿瘤免疫治疗的基础。应用MAGE-A1基因作为疫苗应用于肿瘤治疗的探索性研究较多:
①用MAGE-A1抗原肽疫苗诱导扩增特异性CTL进行过继免疫治疗［2］；②用人工合成的MAGE-A1抗原肽脉冲处理树突状细胞(DC)或用MAGE-A1基因修饰的DC制成DC疫苗,对肿瘤患者进行免疫治疗［3］。而继MAGE-A1基因第一个从黑色素瘤细胞克隆后,目前已发现12个MAGE-A成员并形成一个家族。由于MAGE-A抗原为许多肿瘤所共有,并具有严格的肿瘤表达特异性,因此MAGE-A
家族分子被视为肿瘤免疫治疗的理想靶点［1］。
MAGE-A9是MAGE-A亚家族成员, 由于MAGE-A家族中的部分基因已成为良好的肿瘤靶基因，同时MAGE-A家族基因之间有较高的同源性，故MAGE-A9有可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。因此, 对MAGE-A9基因进行克隆、表达,制备特异性单抗，明确其在肝癌中表达及定位，这不但有助于对MAGE-A9基因功能的研究，对肝癌的免疫治疗也具有重要意义。
本研究利用RT-PCR 方法,从人肝癌组织中克隆出目的基因全长片段,构建了原核表达载体pBAD/gIII-MAGE-A9，通过细胞融合技术，制备了一株抗MAGE-A9分子的单克隆抗体，证实可与MAGE-A9分子特异性结合。在以往研究中，由于缺乏特异性单抗，很多肿瘤因子的表达都是基因水平的研究，关于MAGE-A9在肿瘤中的表达研究也不例外［4］，包括MAGE-A9在食管腺癌相关的Barrett食道中过表达［5］，在皮肤T细胞淋巴瘤阳性表达率27%［6］。但基因与蛋白水平的表达并不完全一致，更重要的是，肿瘤免疫治疗是以抗原的确切定位为基础的。本文在制备了抗MAGE-A9单克隆抗体的基础上，应用免疫组化技术，首次证实MAGE-A9抗原在肝癌癌细胞中主要表达在胞浆，未见同一标本中部分肿瘤细胞MAGE-A9抗原阳性而另一部分肿瘤细胞MAGE-A9 抗原阴性的情况,只是见标本中全部肿瘤细胞MAGE-A9 抗原阳性或全部阴性，这提示,选用MAGE-A9 基因产物作为靶分子对阳性患者进行免疫治疗有可能对全部的肿瘤细胞都产生杀伤效应。本实验结果经统计学分析，认为MAGE-A9在肝癌中的表达于患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性，与赵海涛等检测MAGE-A10在肝癌中的表达与临床病理未见相关性的结果相一致［8］。本实验阳性表达率为21%（8/39），相比MAGE-A1、MAGE-A10等其他MAGE-A家族抗原在肝癌中超过50%［7，8］的表达偏低，可能与以下几方面原因有关：①以往研究以RT-PCR法检测基因表达居多，而本实验采用的是免疫组化法，在方法上可能会存在差异；②肝癌标本代表性不足，本实验标本数量不多，均为肝癌原发灶标本，未涉及肝癌转移灶，且多为中等分化程度的，分化程度较高和较低的肝癌标本基本未包括，亦未收集到不伴慢性肝炎的肝细胞癌标本。今后的研究需扩大样本，同时检测MAGE-A9在常用的人肝癌细胞株（如SMMC-7721、BEL-7402、HepG2等）中的表达情况。
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