【www.zhangdahai.com--福利民政公文】
【摘要】 目的 构建多药耐药（multidrug resistance，MDR）基因-腺病毒重组表达载体。方法 将MDR1基因插入到腺病毒载体，用磷酸钙沉淀法将此重组载体转染到293细胞，制备重组病毒悬液并感染靶细胞进行鉴定。结果 构建的MDR1-腺病毒载体在293细胞中大量产生，病毒滴度达109 PFU/ml，此病毒感染靶细胞后，在靶细胞中有MDR1基因的表达。结论 成功构建了MDR1-腺病毒重组表达载体。
【关键词】 多药耐药基因；腺病毒载体；转染
Construction and identification of multi-drug resistance gene- adenovirus recombinant expression vector LIU Yu-xia,CHEN Jun,YU Hong．Jilin Provincial Institute of Cancer Research,Changchun 130012, China
【Abstract】 Objective Construction of multi-drug resistance gene (MDR) - adenoviral recombinant expression vector．Methods MDR1 gene will be inserted into the adenovirus vector，by calcium phosphate precipitation method the recombinant plasmidtransfect into 293 cells． Recombinant virus suspension is made and infeced target cells and to indentify．Results Constructed MDR1- adenovirus vector produces a large number in 293 cells，the virus titer is up to 109 PFU/ml．After the recombinant virus infectedtarget cells in the target cells have the expression of MDR1 gene．Conclusion MDR1- recombinant adenorirus vector has been successfully constructcd．
【Key words】 Multi-drug resistance gene (MDR1)； Adenovirus vector；Transfection
多药耐药性（multidrug resistance， MDR ）是指肿瘤细胞能对多种结构、功能及杀伤机制均不同的化疗药物产生耐受。肿瘤组织多药耐药性的产生主要是由于肿瘤细胞内多药耐药基因（ MDR1 ）异常扩增和过渡表达所致，表达产物为分子量 170 kd的糖蛋白（ P-glycoprotein ， P-GP ）。该蛋白作为一种依赖 ATP 能量的大分子药物或毒物的溢出泵，可把进入细胞内的药物或异物排出细胞外，使肿瘤细胞产生耐药。利用 MDR1 的这一特性，本研究使用腺病毒作为载体，构建 MDR1 基因-腺病毒重组表达载体，并转导入脐血有核细胞，对此重组载体转染靶细胞的有效性进行鉴定。
1 材料与方法
1．1 材料 PHAMDR 质粒,美国国立健康研究院 Greegar D．Odegaarden 博士惠赠；腺病毒载体试剂盒,DNA 修平试剂盒，粘粒载体，TaKaRa 公司；RPMI1640,GIBCO公司；FCS，TBD公司；DNA纯化/回收试剂盒，北京鼎国；MDR1包装试剂盒，Novagen公司。HEK293 细胞，感受态大肠杆菌DH5α，由吉林省肿瘤防治研究所保存。
1．2 MDR1的体外扩增 将PHAMDR 质粒转化到感受态大肠杆菌DH5α[1]，并将此感受态细菌接种到含氨苄(50 μg/ml)的 LB培养基中筛选阳性克隆进行扩增，用碱裂解法提取PHAMDR 质粒DNA[2]。
1．3 扩增的PHAMDR质粒的鉴定及回收
1．3．1 PHAMDR质粒的鉴定 将提取的质粒DNA沉淀溶解后用Xhol I 和Sac II 进行双酶切，然后将质粒DNA及过夜双酶切的质粒DNA同时用0．8%的琼脂糖进行电泳，鉴定MDR1基因扩增效果，结果见图1、2。
1．3．2 MDR的回收 将电泳所见4．5 kb附近的泳带切回,按DNA回收试剂盒说明进行回收，将回收的DNA贮存于-20℃冰箱。
1．4 MDR1-腺病毒重组表达载体的构建 将回收的MDR1基因用DNA修平试剂盒修平后（DNA-TPC），与粘粒载体(Cosmid DNA)进行连接， 用磷酸钙共沉淀法将Cosmid DNA和DNA-TPC转染到293细胞，2周左右在一些培养孔内可以观察到细胞的病变和死亡，转移这些已经完全死亡培养孔的培养液（含死细胞）到一个消毒的1．5 ml的离心管中，反复冻融6次后，5 000 r/min离心5 min，收集上清，即为重组病毒悬液。储存在-80℃，备用。
1．5 MDR1-腺病毒重组表达载体的鉴定 采用MDR1-腺病毒重组表达载体感染靶细胞（脐血有核细胞）的方法。
1．5．1 脐血有核细胞的获取 用氯化胺裂解法[3]分离脐血有核细胞，调细胞浓度为5×10�7/ml，加入到24孔细胞培养板，每孔100 μl。
1．5．2 病毒感染靶细胞 取在-80℃保存的样品原液以及用含10%FCS DMEM稀释成3、10、20、40倍的样品到24孔培养板，每孔100 μl，各做4个复孔。在感染的前20 min内，摇动培养板3次，每次摇动后均放入37℃，5%CO2培养箱，1 h后完成感染，补加培养液，24 h后检测靶基因的表达。
1．5．3 靶基因的检测 提取以上转染MDR1-腺病毒载体的脐血有核细的DNA，采用PCR扩增法进行 MDR1全长及特异片段的检测。 MDR1全长及特异片段（157 bp）引物均由上海生工合成。MDR1全长序列为：上游引物ATGGATCTTGAAGGGGACCGCAATGGAGG下游引物CATCTCATACAGTCAGAGTTCACTGGCGC。反应体系为25 μl。反应条件： 94℃ 60 s， 55℃ 80 s，72℃ 150 s，共30个循环,72℃延伸10 min；MDR1特异片段（167 bp）序列为：上游引物 CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG下游引物 GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA。反应体系为25 μl，反应条件：94℃ 30 s，55℃ 60 s，72℃ 70 s，共30个循环,每个循环增加1 s,72℃延伸10 min。MDR1全长及特异片段PCR产物分别用0．8%和1．5%的琼脂糖进行凝胶电泳,结果见图3、4。
2 结果
2．1 MDR1体外扩增结果 见图1、2。PHA MDR质粒全长为15 192 bp（见图1）。经XhoI和SacII双酶切后，出现2条泳带，一条为PHA质粒，大约为11 kb；另一条为MDR1，大约为4．7 kb。从电泳结果可以看出，此2条电泳条带位置正好与此符合（见图2）。
1．DNA Marker 2．3．4PHAMDR质粒
图1 PHAMDR质粒1．DNA Marker 2．双酶切PHA MDR
图2 双酶切PHAMDR质粒
2．2 MDR1-腺病毒重组载体转染脐血有核细胞的鉴定 转染MDR1的脐血有核细胞进行DNA提取后，用MDR1全长及特异引物进行PCR扩增，并分别用0．8%和1．5%的琼脂糖进行凝胶电泳，结果见图3、4。MDR1全长大约4．5 kb，从图3可以看出，此位置上可见一泳带；设计的MDR1特异片段为157 bp，从图4可见在此附近有一条泳带，证明MDR1基因已转染入脐血有核细胞。
3 讨论
肿瘤细胞耐药类型分为：原发性耐药、继发性耐药和多药耐药。人类 MDR 基因家族包括 MDR1 和MDR2。其中 MDR1为有功能的耐药基因，其cDNA全长4 669 bp，共编码1 280个氨基酸残基[1]，而 MDR2为无功能耐药基因。1970年， Biedler Riehm 等[2]首先描述了 MDR 表型，即一种药物诱导产生的耐药细胞株可以对其他多种化学结构和功能完全不同的化疗药物产生耐药。利用MDR的特点，本实验采用腺病毒作为载体，将MDR1基因转导入造血细胞，探讨一种有效的基因转导方法，同时可以发挥其对化疗药物的抵抗作用。
基因治疗的成功，在于选择合适的载体和靶细胞。作为常用的基因治疗的病毒性载体，腺病毒载体具有很多优点[4]：首先，其安全性好，经临床和实验证实，无致病和致癌作用，不会引起癌基因激活；宿主范围广，可以感染分裂期和非分裂期细胞；病毒滴度高；装载容量大，且无免疫原性，可反复使用。由于其病毒产量高，可以感染静止期和分裂期的细胞的特点，使之应用起来比较方便，在实际操作中，不必使用造血因子来诱导细胞进入分裂状态即可进行转染，节省了使用造血因子的费用，而且从我们的实验结果可以看出，转染后的耐药效果比较好。
恶性肿瘤化疗过程中对正常细胞及骨髓细胞的损伤常使得化疗方案不能如期实施，从而影响肿瘤化疗的效果。克服这些问题的策略之一就是向造血细胞中导入外源MDR1基因拷贝并使之过度表达，从而使大剂量化疗的反复进行成为可能。本研究基于这一出发点，以经过改造的复制缺陷型腺病毒作为载体，构建了MDR1-腺病毒重组表达载体，并用其感染靶细胞，取得了较好的感染效果。从感染的脐血有核细胞中提取的DNA经PCR扩增后的电泳结果可以看出，腺病毒载体已将MDR1转染入脐血有核细胞中。本实验的结果可以初步证明，使用腺病毒载体可以将多药耐药基因有效地转染到靶细胞（脐血有核细胞）中，此方法将来如果运用于临床，将会增强患者造血干细胞对化疗药物的抵抗性以及对提高化疗疗效发挥很好的作用。
参考文献
1 金冬雁，黎孟枫，等．分子克隆实验指南．科学出版社，2002：908．
2 金冬雁，黎孟枫，等．分子克隆实验指南，1992：19．
3 刘玉侠，夏凤琴，石虹，等．LiCL对脐血有核细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响．实用肿瘤学杂志，1998，12（1）：15．
4 Maione D,Della rocca C,Giannetti P．An improved helper-dependent adenviral vector allows persistent gene expression after intramuscular delivery and overcomes preexisting immunity to adenovirus．Proc Natl Acad Sci USA,2001，98(11):5986-5991．
“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”。
