【www.zhangdahai.com--环保公文】
【摘要】目的：探讨胰岛素对大鼠肝细胞损伤是否具有保护作用。方法：胶原酶原位灌流分离大鼠肝细胞并原代培养，分别用脂多糖（LPS）及胰岛素处理肝细胞，12 h后检测肝细胞损伤及存活率。结果：LPS可引起肝细胞损伤，使丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）增高；胰岛素可减轻上述肝细胞损伤（ALT活性降低55.5%、AST活性降低24.4%，P95%方可用于实验。调整细胞密度为2.0×105/L，接种于24孔(每孔1 ml) 及96孔 (每孔0.1 ml)培养板内，37 ℃、50 ml/L CO2的细胞培养箱中培养24 h后换液。
1.2.1 实验分组:取原代培养24 h的肝细胞分为5组，分别用以下培养液：(1)Normal：无血清DMEM培养液；(2)LPS：含20 μg/L LPS的无血清 DMEM培养液；(3)LPS＋10-9 Insulin：含10-9 mol/L胰岛素和20 μg/L LPS的无血清DMEM培养液；(4)LPS＋10-8 Insulin：含10-8 mol/L胰岛素和20 μg/L LPS的无血清DMEM培养液；(5)LPS＋10-7 Insulin：含10-7 mol/L胰岛素和20 μg/L LPS的无血清DMEM培养液，每组重复数为8，作用12 h后，收集24孔板中细胞培养上清液，并消化细胞。
1.2.2 MTT检测：在培养肝细胞的96孔培养板中每孔加入5 g/L MTT液20 μl，继续培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜150 μl，震荡10 min，用酶标仪于492 nm波长处测定吸光度值。细胞存活率=[(试验组吸光度值－空白对照组吸光度值)/对照组吸光度值]×100%。
1.2.3 ALT和AST测定：采用比色法用自动生化分析仪分别测定各组肝细胞培养上清液中的ALT和AST活性，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
1.2.4 统计学处理：实验数据均以x±s表示，采用 GraphPad Prism 4.0 统计程序进行统计学分析。多组间数据比较采用单因素方差分析 (ANOVA)，若总体差异显著，再以Bonferroni t检验分析相应两组间显著性差别。以P
