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【摘要】 目的 研究中药复方促使T淋巴细胞增殖。方法 从SD大鼠血液里分离淋巴细胞，进行体外培养。设正常细胞对照组、阳性药物对照组、转移因子组、复方中药高剂量组、中剂量组、低剂量组。培养1 d后把药加入培养液中，继续培养2 d，加Am-Blue细胞增殖与活性检测试剂，避光培养4 h后，通过酶标仪检测，分析淋巴细胞的增值情况。结果 中药复方高、中、低剂量组OD值均明显增高，与空白组比较P＜0.01；与阳性药物对照组比较，P＜0.01；高剂量组与中、低剂量组比较P＜0.01；转移因子组与空白组比较P＜0.01。结论 中药复方能促使T淋巴细胞增殖，且与剂量有关。
【关键词】 中药复方；T淋巴细胞；增殖
Study on compound traditional chinese medicine promote toT-lymphocyte proliferation experiment
ZHANG Hui, LI Yu-hu. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Shanghai201203,China
【Abstract】Objective Study of compound traditional Chinese medicine can promote to T-lymphocyte proliferation. Methods Separate T-lymphocyte from blood of SD rat, culture in vitro. Install normal cell control group, active-drug control group, transfer factor group, compound traditional Chinese medicinehigh dose group、middle dose group，low dose group. Give the medicine to culture medium after culture one day. Continue to culture 2 days and take Am-Blue into 96 orifice plate, culture 4 hours in dark. Use enzyme-labelling measuring instrument to measure after three days. Analyse proliferation of T-lymphocyte. Results OD of compound traditional Chinese medicine high dose group、middle dose group、low dose groupcan improve obviously. Theirs compare to blank control group P＜0.01; theirs compare to Active-drug control group P＜0.01; compound traditional Chinese medicinehigh dose group compare to middle dose group、low dose group P＜0.01. transfer factor group compare to blank control group P＜0.01. Conclusion Compound traditional Chinese medicine can promote to T-lymphocyte proliferation, and relation to dosage.
【Key words】Compound traditional Chinese medicine; T-lymphocyte; Proliferation
转移因子(Transfer factor TF)是从致敏动物的白细胞或脾脏、淋巴结等免疫器官中提取的一种低分子量多肽―核苷酸复合物，因其能将供体某种特定的细胞免疫功能特异地转移给受体，故称为转移因子。目前对转移因子的研究很多，本研究通过转移因子与中药的复方来研究中药复方对体外培养的大鼠淋巴细胞的影响作用，分析复方转移因子各种组别对细胞增殖的影响及与剂量的关系，为后续的体内试验提供参考依据，探讨复方中药免疫增强作用和对复方转移因子的临床应用开发奠定基础。
1材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物SD大鼠，雄性，体质量（180±10）g，清洁级动物，中科院上海实验动物中心提供。
1.1.2实验室气象条件温度22℃～25℃，湿度40%～70%。
1.1.3试剂与仪器
1.1.3.1试剂 淋巴细胞分离液（Sigma公司）、RPMI1640培养液、胎牛血清（FCS）、Am-Blue细胞增殖与活性检测试剂（SunBioTM公司）、PHA（植物凝集素）、IL-2（Sigma公司）；复方转移因子，本实验室制备。健康猪脾，用超滤仪超滤，得转移因子溶液（10 mg/ml左右）。中药（ 紫花地丁、野菊花、甘草等）煎煮2次，浓缩后加食用酒精提取。二者按一定的比例混合，得复方中药。复方中药中的转移因子含量为0.05g/10ml和中药生药含量为5 g/10 ml。
1.1.3.2 仪器 CO2培养箱（RSBiotech公司））、Elx800酶标仪（美国BIO-TEK公司）。
1.2方法
1.2.1 采血
每次试验均先麻醉SD大鼠，用5 ml注射器（预先抽取0.2 ml肝素）从大鼠腹主动脉抽血
3 ml。
1.2.2分离
将血液缓慢加入预先已加入淋巴细胞分离液的离心管中，血液与分离液的比例为1∶1。以
4℃、2000 r/min 离心20 min，液相分为三层，上层为自体血清层，中层为淋巴细胞层（乳白色云雾状），下层为分离液和红细胞层。用微量进样器抽取淋巴细胞放入无菌的离心管中。
1.2.3 洗涤
将收集到的淋巴细胞集中于一支离心管中用PBS洗涤2次，均以2000r/min离心10 min，弃上清。
1.2.4 培养
洗涤后得到的淋巴细胞团用少量RPIM1640培养液(含10％血清)打散，用血细胞计数板统计调节细胞初始浓度至1×105，取160 µl转入96孔培养板，于CO2培养箱中培养，条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。
1.2.5 分组
在96孔板中设置正常细胞组，阳性药物对照组（含ＰＨＡ和ＩＬ－２），转移因子组（TF组）复方中药高剂量组、中剂量组、低剂量组，同时设置空白对照孔（含培养液和Am-Blue试剂）。
1.2.6 加药
培养一天后在正常细胞组中加入40 µl无菌生理盐水，在阳性药物对照组中加入40 µl PHA（100µg/ml）和IL-2，在TF组中加入40 µl TF，在复方中药高剂量组中加入40 µl药物，中剂量组中加入20 µl药物和20 µl生理盐水，低剂量组中加入5 µl药物和35 µl生理盐水。培养72 h后加入Am-Blue检测试剂20 µl/孔。
1.2.7 检测
培养4 h后，可见无荧光的靛青蓝变为有荧光的粉红色，上酶标仪检测。以570 nm波长检测各孔OD值。
1.2.8 统计学方法
实验数据以均值±标准差( ±s)表示,用统计软件SPSS13.0 进行统计分析，统计方法用单因素方差分析。
2 结果
2.1 药物组与正常细胞组比较对淋巴细胞增值的影响（见表1）。
由表1可知，阳性药物对照组，转移因子组，复方中药高、中、低剂量组均极显著地促进淋巴细胞的增值，P＜0.01。6个药物组促进淋巴细胞增殖的强弱顺序依次为复方中药高剂量组＞复方中药中剂量组＞复方中药低剂量组＞TF组＞阳性药物对照组。
2.2 复方中药组、TF组与阳性药物组比较对淋巴细胞增殖的影响（见表1）
由表1可知，复方中药高、中、低剂量组与阳性药物组比较P＜0.01；TF组与阳性药物组比较P＜0.01。
2.3复方中药组高、中、低剂量组比较对淋巴细胞增殖的影响（见表1）
由表1可知，复方中药高、中剂量组与低剂量组比较P＜0.01。 可见复方中药对淋巴细胞的增值作用与剂量关系密切。
3 讨论
机体免疫系统中淋巴细胞增殖是机体对非己抗原刺激产生免疫应答过程中的重要事件。淋巴细胞增殖结果表现为产生效应淋巴细胞。清除非己抗原，维护机体内环境稳定。T细胞活化是细胞免疫应答早期的重要变[1],化淋巴细胞增殖效果决定效应淋巴细胞的数量，决定了机体免疫应答反应的强度，反映机体的细胞免疫状态[2]。因此，淋巴细胞增殖实验的结果是细胞免疫的一个测定指标。
转移因子(Transfer factor，TF)是存在于人和动物免疫淋巴细胞内的可透析的小分子物质，属于多肽和多核苷酸类，分子质量大约为3～15 ku。TF成分复杂，它能够特异性将供体细胞免疫力传递到受体细胞内，特异性地增强受体免疫功能，是一种新型免疫激发剂，且具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂[3]。转移因子自1953被Sherwood Lawrence[4]发现以来,作为具有特异和非特异性免疫活性的细胞调节因子,免疫增强剂已显示出其广阔的应用前景,也吸引着大批国内外科学工作者从事转移因子实验及临床研究。转移因子对各类疾病的治疗机理的报道也日趋增多。目前很多学者将TF应用于特种经济动物传染病的治疗，取得较大的进展[5]。
PHA和IL-2能促使体外淋巴细胞增殖，IL-2是淋巴细胞体外增殖的必备条件。本实验PHA和IL-２的用量分别是100 µg/ml、100 µg/ml。本实验使用Am-Blue 细胞增殖与活性检测试剂来替换MTT。Am- Blue 细胞增殖与活性检测试剂是一种能简便、迅速、可靠地定量检测多种动物细胞系、细菌、真菌增值与活性的试剂。与MTT相比有以下优点：1，操作简捷，一步到位；2，无细胞毒，后续可用；3，应用广泛，用途多样；4，双色检测，灵敏度高；兼容性强，稳定性好。如今在国外使用频繁。
本实验结果显示，8个组均能不同程度低促进淋巴细胞的增值，复方中药组明显优于其他组，尤以复方中药组促进淋巴细胞增值的作用最佳，差异有统计学意义（P＜0.01）。提示复方中药可以促进淋巴细胞的增值，且效果明显，中药与转移因子组成的复方不是简单的相加，它们在发挥免疫调节功能时具有协同促进作用。这为进一步探讨复方中药的临床应用奠定基础。
参考文献
[1] 侯会娜,曾耀英，等. 金银花提取物对小鼠淋巴细胞体外活化与增殖的影响.免疫学杂志，2008，24（2）：183.
[2] 赵洁，王曦鸣，李继祥. MTT法检测淋巴细胞增殖能力的影响因素.畜禽业，2008，226（2）：28.
[3]孙卫民，王惠琴．细胞因子研究方法学.人民卫生出版社，2001.
[4] Lawrence HS. The transfer in humans of delayed skin sensitivity to Streptococcial M
substances and to tuberculin with disrupted leukocytes. J Clin Invest，1955，34:219-
230.
[5] 常建军. 转移因子的研究现状及临床应用进展.青海大学学报（自然科学版），2007，25(2):34-35.
