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【摘要】 目的 研究大鼠创伤性脑损伤后脑组织ICAM-1和血糖变化与神经细胞凋亡的关系。方法 采用大鼠自由落体脑损伤模型(Feeney’s model),分别在伤后6、24、72、168 h 免疫组织化学检测ICAM-1、Hoechst染色定量凋亡细胞; 测定伤前0．5 h 及伤后6、12、24、48、72、120、168 h 各组动物的血糖值。结果 脑损伤程度越重，ICAM-1的IOD值、血糖浓度和神经细胞凋亡的个数升高的速度越快、峰值越高；神经细胞凋亡的个数从伤后6 h即明显高于对照组，并持续增高。结论 创伤性脑损伤后早期神经细胞凋亡可能与ICAM-1介导的细胞黏附及升高血糖的胰高血糖素、糖皮质激素等介导的细胞凋亡有关。
【关键词】 创伤性脑损伤；ICAM-1；细胞凋亡；血糖
The relationship of ICAM-1 and changes in blood glucose and cell apoptosis after traumatic brain injury in rats
WANG Feng-he.Department of Neurosurgery,People’s Hospital of Yanzhou,Shandong 272000,China
【Abstract】 Objective To study the relationship of ICAM-1 and changes in blood glucose and cell apoptosis after traumatic brain injury in rats.Methods Based upon the Feeney’s model,Intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1)and Cell apoptosis of each animal group were measured 6,24,72,168 hours after the injury.The blood glucose concentration of each animal group were measured at half on hour hour before the injury and 6,12,24,48,72,120,168 hours after the injury.Results The severer the trauma was,the faster the blood glucose concentration and the IOD of ICAM-1 and the number of cell apoptosis increased.The number of cell apoptosis increased markedly at 6 hours after the injury,and increased continually.Conclusion The over expression of ICAM-1 and that which increased blood glucose concentration such as glucagons and cortisolmay be the cause of inducing cell apoptosis.
【Key words】
Traumatic brain injury;Intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1);Cell apoptosis;Bloodglucose
创伤性脑损伤后脑组织发生一系列病理变化,以往的研究认为神经细胞是不易发生凋亡的细胞。近几年国内外均有动物实验证实脑外伤后存在神经细胞凋亡[1-3]。并认为脑损伤后迟发性神经元凋亡是产生继发性脑损害的主要途径[4]。 创伤性脑损伤后脑组织ICAM-1(Intercellular adhesion molecule 1)和血糖变化与细胞凋亡关系的研究尚未见报道,现报告如下。
1 材料与方法
1．1 主要实验器材与试剂 自制改进型Feeney自由落体脑损伤装置。One Touch Ⅱ型微型血糖仪，购自美国Johnson公司。Leica TCS SP2荧光显微镜购自德国Leica公司。紫外分光光度仪，购自美国PE公司。大鼠抗大鼠ICAM-1、多克隆抗体、二抗、S-P9000免疫组织化学染色试剂盒,以上均购自北京中山生物技术有限公司。DAB显色剂(AR1022),购自武汉博士德生物工程有限公司。细胞凋亡Hoechst染色试剂盒,购自碧云天生物技术公司。
1．2 实验动物及分组 健康、成年雄性Wistar大鼠(中南大学动物中心提供)共72只，体质量220～240 g。将实验动物按假手术组、轻型脑损伤组、重型脑损伤组，脑外伤后6、24、72、168 h随机分成12组(每组6只)。
1．3 实验模型准备 实验模型采用自制改进型Feeney自由落体脑损伤装置。用20 g砝码从20 cm高处坠落致轻型脑损伤，另用40 g砝码从20 cm高处坠落致重型脑损伤。假手术组仅作颅骨钻孔而不致伤。
1．4 免疫组织化学检测ICAM-1 分别于模型建立后6、24、72、168 h取标本，固定，切片，PBS冲洗，3％H2O2室温孵育，PBS冲洗，滴加正常山羊血清封闭液，滴加ICAM-1抗体，4℃过夜，PBS冲洗，滴加二抗，PBS冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色，PBS冲洗，苏木精复染，盐酸酒精分化，封片，显微镜下观察。所有切片进入LASERPIX，在×200镜下，随机选取5个视野，应用image pro plaus程序，对ICAM-1的表达进行半定量分析，记录IOD(Intergrated optical density)值。
1．5 细胞凋亡Hoechst染色 分别于模型建立后6、24、72、168 h取标本，固定，切片，Hoechst染色试剂盒染色，荧光显微镜下观察、照相并计数。
1．6 血糖测定 分别在伤前0．5 h及伤后6、12、24、48、72、120、168 h 测定各组动物的血糖。每次取鼠尾血一滴用One Touch Ⅱ型微型血糖仪测定血糖。
1．7 统计学处理 数据用SPSS12．0软件统计学处理。结果以均值±标准差(x±s)表示，采用随机区组设计方差分析，两组间比较采用t检验。
2 结果
2．1 脑组织ICAM-1蛋白测定 免疫染色阳性细胞呈棕黄色，在脑外伤6 h后皮质损伤边缘等处即有表达；24 h后皮质及损伤边缘表达达峰值持续至24 h，24 h后损伤侧皮质ICAM-1表达减少，颜色变浅，侧脑室壁亦出现ICAM-1表达，损伤7 d后仍有少量表达。
2．2 图像分析
2．3 大鼠脑内神经细胞凋亡计数 用Hoechst33258法对凋亡细胞进行定量，在荧光显微镜下可很好地显示出正常细胞与凋亡细胞或坏死细胞核的差异。取高倍镜下5个视野进行凋亡细胞计数。
2．4 血糖含量 大鼠创伤性脑损伤后血糖含量结果见下表。轻型脑损伤组大鼠的血糖含量伤后12 h即显著地升高，伤后48 h达高峰，以后渐降；重型脑损伤组大鼠的血糖含量伤后6 h即显著地升高，伤后24 h达高峰，以后渐降。
3 讨论
细胞间黏附分子-1(ICAM-1)又称CD54,属于免疫球蛋白超基因家族，能够被血管内皮细胞、神经胶质细胞等表达，颅脑损伤后诱导发生继发性脑损害。本实验显示，ICAM-1表达在脑损伤6 h后即升高，3 d时达高峰，7 d时仍高于对照组的对应值；且脑损伤越重ICAM-1表达阳性细胞的IOD值越高。ICAM-1与神经细胞凋亡呈正相关(r=0．83)，其可能作用机制为：脑损伤后内皮细胞上的ICAM-1表达增加，同时在趋化因子的作用下淋巴细胞上的整合蛋白LFA-1由低亲和性转换成高亲和性[5]，并易与内皮细胞上的ICAM-1黏着，激活的淋巴细胞游走并到达靶细胞，其表达的FasL增加，与靶神经细胞上的Fas结合，可诱导Fas阳性细胞凋亡。
本实验显示血糖变化与神经细胞凋亡也成正相关(r=0．78)。轻型脑损伤组大鼠的血糖含量在伤后12 h即显著升高，伤后48 h达到峰值，以后逐渐下降，伤后7 d血糖水平始终高于正常；重型脑损伤组大鼠的血糖含量在伤后6 h即显著升高，伤后24 h达到峰值，以后逐渐下降，伤后7 d血糖水平始终高于正常。血糖变化与神经细胞凋亡也成正相关(r=0．78)，其可能机制为：生物体是一个整体，其在受到颅脑损伤时,由于疼痛、精神紧张、失血、失液等因素的影响,交感神经-肾上腺髓质轴可出现应激效应[6],血中儿茶酚胺、胰高血糖素、糖皮质激素分泌增加[6],一方面致血糖增高;另一方面 胰高血糖素、糖皮质激素等通过与靶神经细胞膜上的受体结合，将信号传递到靶神经细胞内，使其胞浆中的钙库(线粒体、内质网等)中的Ca2+释放至胞浆，使胞浆中的Ca2+浓度急剧升高，使核酸内切酶活化，核酸内切酶水解DNA，致靶神经细胞凋亡。Rosner等[7]报道大鼠脑损伤后血糖升高，同时生长激素分泌增加。胡卫星等[8]在兔脑损伤模型实验中发现，脑损伤后动物胰高血糖素含量增加。以上资料从侧面证明我们对血糖变化与神经细胞凋亡关系推断的正确性。
研究血糖变化与神经细胞凋亡的关系有重要的实践意义。脑损伤后迟发性神经细胞凋亡是产生继发性脑损害的主要途径，而通过检测血糖可以间接判断神经细胞凋亡情况。直接测量胰高血糖素、糖皮质激素等虽然可能较准确地反映神经细胞凋亡情况，但技术条件要求高，价格昂贵，而血糖的检测在我国基层医院已经普及，价格低廉。通过检测血糖变化来间接地了解神经细胞凋亡情况，既达到了辅助诊断、判断预后的作用，又简便易行，值得在临床推广。
参考文献
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4 Rink A,Fung KM,Trojanowski JQ,et al.Evidence of apoptotic cell death after experimental traumatic brain injury in the rat.Am J Pathol,1995,147(6):1575-1583.
5 杨光华.病理学.人民卫生出版社，2002:63.
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8 胡卫星，顾培元，吴幼章，等.实验性脑损伤超急性期脑糖代谢的变化.中华实验外科杂志，1998，15(6)：553-554.
