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【摘要】 目的 应用PCR-Single-Stronded conformation poly morphism（PCR-SSCP）技术对先天性软骨发育不全患者进行检测。方法 对3例疑似先天性软骨发育不全患者、1例确诊患者应用基因组DNA聚合酶链反应-单链构象多态技术进行检测。结果 3例疑似患者中2例出现和确诊患者同样的异常泳带，此泳带在正常人中不存在。结论 PCR-SSCP技术可实现对先天性软骨发育不全患者的检测。
【关键词】 先天性软骨发育不全；聚合酶链反应；单链构象多态
Detection of achondroplasia by PCR-SSCP
ZHAO Xin,WU Yu,ZHU Xiao-he.
【Abstract】 Objective To detection achondroplasia by PCR-SSCP.Methods The genomic DNA from 1 clinically diagnosed achondroplasia patient and 3 suspicious patients with achondroplasia was diagnosed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-SSCP).Results 2 in 3 suspicious patients with achondroplasia have the same abnormal band,which does not exist in normal people.Conclusion PCR-SSCP can be usedthe diagnosis of achondroplasia.
【Key words】 Achondroplasia;Polymerase chain reaction;Single-Stronded conformation poly morphism
先天性软骨发育不全(achondroplasia，ACH)是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，在活产婴儿中的发病率为1/15 000～1/77 000，为常染色体显性遗传，无家族史，约80%患者为散发型。表现为短肢型身材矮小，头大，前额和顶骨圆凸，鼻梁下陷，腰椎前凸，弓形腿，“V”字形手等。至今已发现ACH的3种基因突变，均位于FGFR3跨膜区，多数为1 138位核苷酸的G→A转换，少数为G→C颠换，还有个别为1 123位核苷酸的G→T颠换。
1 对象与方法
1．1 对象 沈阳市中国医科大学第二附属医院儿科遗传门诊的3例疑似ACH患者、1例确诊患者和1名无ACH家族史的正常人。
1．2 方法
1．2．1 DNA模板的制备 取受试者静脉血5 ml，加EDTA抗凝剂0．5 ml混匀，用常规方法，血标本经蛋白酶K处理，苯酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，沉淀物溶于缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7．4；1 mmol/L EDTA，pH8．0)。所得DNA用紫外分光光度计检测吸光度，A260/A280约为1．8。
1．2．2 基因片段PCR扩增 引物合成：上游引物和下游参照文献[1]，由上海博亚公司合成，引物序列为：5′-AGGAGCTGGTGGAGGCTGA-3′和5′-GGAGATCTTGTGCACGGTGG-3′PCR反应体系：每25 μl反应体系中，含10×PCR缓冲液�2．5 μl�，dNTP2 μl，上游和下游引物各2．5 μl，TaqDNA聚合酶0．2 μl，去离子水10．3 μl，模板DNA5 μl。
反应程序：94℃变性8 min后，按94℃40 s、65℃30 s、72℃40 s循环30次，最后72℃延伸7 min结束反应。
1．2．3 PCR扩增产物鉴定 取PCR扩增产物10 μl，指示剂溴酚蓝1 μl混匀后加入2%琼脂糖凝胶孔中，电泳缓冲液1×TDE，80 V电泳30 min，溴化乙锭染色后紫外灯下观察。检查有无扩增出目的条带及扩增出的目的条带是否理想，如不理想或有非特异性条带存在， 则重新扩增直至得到较理想的扩增产物。
1．2．4 单链构象多态性分析 取PCR产物5 μl，加入等体积的变性液(95%甲酰胺，20 mmol/L EDTA，0．05%二甲苯蓝，0．05%溴酚蓝)混匀，97℃变性10 min，使PCR产物解为单链，立即将解链产物置冰浴中骤冷5 min。将此变性产物加入12%非变性聚丙烯酰胺凝胶(49∶1)中，室温100 V恒压垂直电泳200 min。待溴酚蓝走至胶底，二甲苯蓝走至约2/3胶长时，停止电泳。溴化乙锭染色，紫外灯下检测电泳条带并照相。
2 结果
2．1 PCR扩增产物鉴定结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，观察证实每一标本都扩增出来。
2．2 单链构象多态性分析结果 样品DNA经SSCP分析，3例疑似ACH患者中发现P1、P2存在和阳性对照相同的单链泳动变位，带形一致，说明存在相同的DNA碱基变异。另外1例疑似患者P3以及正常对照未发现单链泳动变位。见图1。
3 讨论
先天性软骨发育不全(ACH)是小儿遗传性侏儒症中最常见的类型，是一种由于软骨内化骨缺陷导致的发育异常，又称胎儿型软骨营养障碍、软骨营养障碍性侏儒等。ACH是完全外显的常染色体显性遗传，无家族史，约80%患者为散发型，为新生突变，与父亲年龄较大有关。近十年来，对此症的基因诊断有了突破性的进展。Shiang等[1]和Rousseau等[2]发现成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)跨膜区基因第10外显子1 138位核苷酸的点突变是ACH发病的原因，其中95%以上为G→A转换，尚有少数发生G→C的颠换，该突变使得第380位密码子由编码甘氨酸转变为精氨酸，导致跨膜
区结构发生变化，从而引起成纤维细胞生长因子受体3蛋白异常，最终导致先天性软骨发育不全。1994年，Francomano等[3]通过连锁分析，将ACH的致病基因定位于4p16．3，研究发现FGFR3也恰在此范围内。FGFR3是一种酪氨酸激酶受体，含有806个氨基酸残基，FGFR3基因长约15 Kb，由19个外显子和18个内含子组成[4]，其中第10外显子编码FGFR3跨膜区。
国外学者Superti-Furga等[5]和Ivegawa等[6]还发现极少数患者不是FGFR3跨膜区380位的突变，而是FGFR3跨膜区375位的突变，即由半胱氨酸替代了甘氨酸。然而这种突变也局限在FGFR3的跨膜区，进一步说明FGFR3跨膜区与软骨发育不全的发病机制有关。
目前用于检测基因点突变的方法有很多，其中Orita等[7]建立的SSCP技术具有简便、快速和适于大样本筛查等优点，可用于检测单个碱基置换、数个碱基插入或缺失等基因变异。经与PCR技术结合，在突变分析中发挥着重要的作用。PCR-SSCP的原理是PCR产物变性后可产生两条互补的单链，各单链根据自己的一级结构而形成不同的构象。单链DNA的构象主要取决于其碱基序列，长度相同，但碱基序列不同甚至单个核苷酸发生突变，其单链的构象也随之变化，并导致电泳迁移率的差异，在电泳凝胶上显现出不同带形。影响PCR-SSCP方法检出突变的因素较多，如扩增片段的长度、突变性质、电泳支持介质及工作条件等等。用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高[8]，根据资料显示，对于200 bp的片段，检出率>90%[9]，本文的扩增片段长度为164 bp，故可期望获得较高的检出率。PCR-SSCP分析方法检测基因突变的优点在于操作简便、快速、经济、易于掌握，已被广泛用于筛查已知突变位点，识别未知突变，以及多态性的分析。
同时SSCP作为筛查某一区域DNA点突变的灵敏的分子生物学检测技术，其检测条件可因DNA片段长度及核苷酸组成有很大差别，电泳条件可因突变类型不同而各异，故较难掌握；其二，可因加量不适当导致多态性条带，与正常条带重叠不易判断；另外还可由于变性不彻底而出现双链，特别是异源双链的干扰而影响实验结果的准确性。
参考文献
1 Shiang R,Thompson LM,Zhu YZ,et al.Mutations in the transmembrane domain of FGFR 3 cause the most common genetic form of dwarfism.Achondroplasia.Cell,1994,78(2):335-342.
2 Rousseau F,Bonaventure J,Legeai-Mallet L,et al.Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in achondroplasia.Nature,1994,371:252-254.
3 Francomano CA,Ortiz de Luna RI,Hefferon TW,et al.Localization of the achondroplasia gene to the distal 2．5Mb of human chromosome 4p.Hum Mol Genet,2004,3(5):787-792.
4 Perez-Castro AV,Wilson J,Altherr MR.Genomic organization of the mouse fibroblast growth factor receptor-3(FGFR3)gene.Genomics,1995,30(2):157-162.
5 Superti-Furga A,Eich G,Bucher HU,et al.A glycine375-to-cysteine substitution in the transmembrane domain of the fibroblast growth factor receptor-3 in a new born with achondroplasia.Eur J Pediatr,1995,154:215-219.
6 Ikegawa S,Fukushima Y,Isomura M,et al.Mutations of the fibroblast growth factor receptor-3 gene in one familial and six sporadic cases of achondroplasia in Japanese patiants.Hum Genet,1995,96:309-311.
7 Orita M,Iwhana H,Kanazawa H,et al.Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation polymorphisms.Proceedings of the National Academy of Sciences,1999,86:2766-2770.
8 Sheffield VC,Beck JS,Kwitek AE,et al.The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single basesubstitutions.Genomics,1993,16:325-332.
9 Gaidano G,Ballerini P,Gong JZ,et al.p53 mutations in human lymphoid m alignancies:association with Burkitt lymphoma and chronic lymphocytic leukemia.Proceedings of the National Academy of Sciences,1991,88:5413.
