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【摘要】 目的 增强多糖抗原在婴幼儿中的免疫原性，提供有效的免疫保护。方法 采用液体培养，收集菌体，脂多糖（LPS）提取，纯化脂多糖，活化脱毒多糖（O-SP）与破伤风类毒素（TT）共价结合。ELISA法检测O-SP及结合物的免疫效果。结果 单纯甲型副伤寒脱毒脂多糖未能诱导小鼠产生抗体，而与TT结合后，具有良好的免疫原性，能产生体液免疫反应，诱导小鼠产生较高水平的抗脂多糖抗体和抗破伤风抗体。结论 破伤风类毒类对甲型副伤寒脱毒脂多糖具有免疫增强作用。
【关键词】 甲型副伤寒脱毒脂多糖;破伤风类毒素;免疫原性
The function of of S.paratyphoid A-tetanus toxoid’s immunity enhancement to the detoxified lipopolysaccharideDAI Chang-hai, BAI Cong, HUANG Fei, et al. Changchun Research Institute of Biologicals, Jilin 130062,China.
【Abstract】 Objective To increase theimmunognicity of detoxified lipopolysaccharide in infantile in order toprovide stronger protection.Methods The detoxified lipopolysaccharide（LPS） antigen was obtained and purified from S.Paratyphi A strain which was multiplicated by submerged culture. The O-SPwas covalent bond to the TT. The immunity effect was detected by ELISA.Results The IgG antibodies were not detected in the serum of mice immunized by detoxified lipopolysaccharide of S.Paratyphi A alone.The conjugate composed of detoxified LPS and tetanus toxoid elicited high anti-LPS IgG and anti-TT IgG level. Conclusion S.paratyphoid A-tetanus has immunity enhancement to the detoxified lipopolysaccharide.
【Key words】 S.paratyphoid A; Tetanus toxoid; Immunogenicity
作者单位：130062 长春生物制品研究所
近年来我国西南及东南沿海省份甲型副伤寒病例逐渐增多， 1998～2002年浙江省3个地区发生了甲型副伤寒爆发病情,杭州市暴发流行5起［1］；贵州省发生暴发流行16起［2］。因此，急需研究安全有效易于推广的甲型副伤寒疫苗来满足疾病预防控制的需要。本次试验研究甲型副伤寒脱毒脂多糖与破伤风类毒素结合后可以增强婴幼儿的免疫原性，提供有效的免疫保护并降低病菌携带率［3］。动物试验结果表明结合后安全稳定，免疫原性优于单纯多糖。
1 资料与方法
1.1 试剂 溴化氰（CNBr）、 己二酰肼（ADH）、 碳二亚胺（EDAC）、购自Sigma公司 Sepharose CL-6B凝胶、层析系统、组分收集器购自Phamacia公司。
1.2 血清及抗原 副伤寒多糖、抗血清；破类及破抗均由本室提供。
1.3 实验动物 实验动物由本所动物室提供。
1.4 脱毒脂多糖的活化 将浓缩的脱毒脂多糖溶于PBS中，加入CNBrpH 11.0反应6 min，加入等体积ADH反应15 min，以0.1 mol HCl调节并维持pH 8,5左右，反应12 h, 2℃～8℃。透析收集活化多糖。
1.5 活化多糖与破类结合 活化多糖浓度为5 mg/ml，加入等量的破类调PH5.4，加入EDAC维持PH5.4冰浴4 h，透析48 h，离心收集上清；Sepharose 4FF层析收峰后除菌过滤，2～8℃保存。
1.6 动物安全试验
1.6.1 异常毒性试验 体重18～22 g小鼠5只，腹腔注射0.5 ml，250～350 g豚鼠2只，腹腔注射5 ml，观察7 d。
1.6.2 异常毒性试验 体重250～350 g豚鼠4只皮下注射2 ml/只于7、14、21 d观察。
1.6.3 毒性逆转试验 将结合物37C放置42 d，接种体重250～350 g豚鼠4只，皮下注射5 ml/只，于7、14、21进行观察。
1.6.4 ELISA检测 包被抗原为副伤寒脂多糖10ug/ml，第二抗体为HRP标记抗鼠IgG和IgM，测定OD490值，待检血清1:100稀释后测定值为一个ELISA单位，计算各组小鼠抗体水平。
2 结果
2.1 结合物的检测 连续三批结合物多糖蛋白比率在0.65～0.75之间；O-乙酰基含量在0.45～0.65 mmol/g之间；KD≤0.2时回收率80%以上；高分子含量90%以上。见表1。
表1 脱毒脂多糖结合物检测结果
2.2 动物安全试验
2.2.1 异常毒性试验 连续三批结合物样品注射小鼠及豚鼠，观察7 d，动物无死亡，体重增加，无异常反应，试验合格。
2.2.2 特异性毒性试验 连续三批结合物样品注射21 d后观察，无局部化脓、坏死现象；无破伤风症状，体重增加，试验合格。
2.2.3 毒性逆转试验放置37℃42 d的三批结合物样品，注射21 d后，动物无死亡，体重增加，毒性逆转试验合格。
2.3 ELISA检测结果 结合物注射7、14、21 d后，抗体水平明显升高，阳转率为100%，而单纯脱毒脂多糖注射三针后抗体滴度为零。见表2。
表2 ELISA检测结果
3 讨论
随着耐药菌株的不断增多，细菌性疫苗的开发重新受到关注，细菌多糖于载体蛋白的结合成为现实，从而极大地改进了一些细菌多糖疫苗的有效性，将多糖-蛋白结合后可以克服多糖抗原自身缺点，提供安全、有效、持久的免疫保护［4］。
革兰阴性杆菌细胞壁的细菌脂多糖作为重要的保护性抗原。在去除脂质A部分后，免疫小鼠产生的抗体水平很低几乎为零。而与蛋白结合后免疫小鼠能诱导产生高水平的血清IgG抗体，与之相比有显著提高［5］。
参考文献
［1］ 孙阳，邓晶.杭州市 2000～2002年急性肠道传染病爆发疫情分析.浙江预防医学，2004,16（12）：13-14.
［2］ 田克成.贵州省2000年甲型副伤寒沙门菌分离柱16SrRNA基因型分析.疾病监测，2001,16（12）：445-447.
［3］ 刘宝奎.伤寒疫苗的研究进展.中国计划免疫，1998,4（4）：237-240.
［4］ Cohen D,Ashkenazi S,Green MS,et al. Safety and immunogenicity of investigational shigella conjugate vaccines in Israeli volunteers.Infect Immun,1996,64（4）:497-4102.
［5］ Lin F.The efficacy of a salmonella typhi conjugate vaccine in two-to-five-year-old children.N Engl J Med,2001,344（12）:1263.
