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[摘要]目的 检测不同病程糖尿病模型大鼠的心肌背向散射积分(IBS),同时观察纤维化指标,探讨IBS与心肌纤维化的关系。方法 腹腔注射链尿佐菌素(65 mg•kg-1)建立SD大鼠糖尿病模型,于第4、12、24周测定常规心功能参数(LVEF)、左室后壁校正IBS值(IBS%)、IBS周期性变异幅度(CVIB)。同期检测心肌纤维化指标:心肌羟脯氨酸含量(HPC),Masson染色观察胶原纤维容积分数(CVF)及血管周围胶原面积(PVCA),用免疫组织化学法对心肌胶原蛋白在心肌的分布及表达进行半定量分析,光镜与透射电镜对心肌行组织学观察,并与同龄正常大鼠进行比较。结果 (1)与对照组比较,糖尿病组的IB%明显增高(P0.05),第24周时明显降低(P0.05);糖尿病组心肌纤维化指标HPC、CVF、PVCA、胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达均明显增高(P0.05).Compared with the control group,HPC,collagen volume fraction(CVF),perivascular collagen area(PVCA),and the expression of the type Ⅰ and Ⅲ collagen in heart were increased in diabetic rats(P[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)在组织形态学上主要表现为心肌细胞肥大、心肌间质胶原沉积和心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)。本实验通过检测不同病程糖尿病大鼠心肌的IBS,同时观察MF指标并与正常对照组比较,探讨IBS与MF的关系,为超声心动图正确评价及早期发现DCM提供实验依据。�
1 材料与方法�
1.1 糖尿病大鼠模型的制备及分组�
8周龄SPF级健康雄性SD大鼠50只(购自北京维通利华实验动物中心),体重180～210 g,平均(199.64±11.04) g。抽签法随机选取32只按65 mg•kg-1腹腔注射链尿佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司)。注射后3 d及�7 d,断尾法用ACTIVE血糖仪(上海罗氏医药公司)测血糖,将血糖稳定大于16.7 mmol•L-1、尿糖持续阳性者定为糖尿病大鼠模型(DM组)。除去未成模4只及死于急性并发症大鼠10只,余下的18只随机分为4、12、24周组,每组6只,同时随机选取同周龄大鼠各6只作为正常对照(CN)组。�
1.2 超声检测�
大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg•kg-1)麻醉后取左侧卧位,应用HP-SONOS-5500超声诊断仪,S8探头,于M型超声下检测左心室波群并测量大鼠左室舒张内径(Dd)、收缩末期内径(Ds),计算左室射血分数(LVEF)。启动声学密度(AD)定量系统,调节深度(�2～3 cm)、总增益、时间补偿增益及侧方增益补偿,获得满意的左室长轴及乳头肌水平左室短轴切面,将连续2.48 s内62帧图像存入磁光盘。感兴趣区(ROI)置于左室后壁中间段的心肌层及心腔内,随心动周期运动。测得以下参数:峰-峰强度(PPI,即背向散射积分周期变化值,CVIB),平均图像强度(AII,即IBS),图像背向散射标准差(SDI)。心肌校正IBS(IBS%)=心肌层IBS值/心腔血流IBS值。�
1.3 标本采集�
腹主动脉放血处死动物,立即取左室心尖部1 mm×1 mm×2 mm左右心肌组织2块,放入2.5%戊二醛中,保存于4 ℃冰箱,用于电镜观察。将心脏自心尖部至心底部横断为3份,取中间段放入10%中性福尔马林中固定,做好标记,用于组织形态学观察(Masson三色染色、免疫组织化学染色),另2份放入做好标记的冻存管中,并立即投入液氮中,然后转移至-70 ℃冰箱,用于心肌羟脯氨酸(HPC)检测。�
1.4 心肌HPC浓度测定�
试剂盒购自南京建成生物技术公司。碱水解法进行前处理,用722可见分光光度计测550 nm处各管吸光度值,计算HPC。�
1.5 Masson三色染色法进行胶原染色�
应用Masson三色染色法对心肌进行染色(试剂盒购自福州迈新生物技术公司),胶原纤维呈蓝色,心肌细胞呈红色。用图像采集系统(Olympus公司)采图,Motic Med数码医学图像分析系统计算心肌胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)。CVF=胶原面积/总面积,其中胶原面积不包括血管周围胶原面积;PVCA=壁内小动脉管腔周围胶原面积/该小动脉管腔面积。每组取12张切片,每张切片随机取5～�10个200倍显微视野图像。
1.6 免疫组化染色测定胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达�
石蜡切片,TGF-β1采用柠檬酸高压抗原修复,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ采用复合消化液酶修复,分别滴加抗兔胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ(武汉博士德生物制品公司)稀释一抗(1∶100),放入4 ℃冰箱过夜。再滴加生物素化山羊抗兔IgG和试剂SABC,DAB显色。每组取12张切片,每张切片随机取10～15个200倍显微视野图像,测定平均积分光密度(intergrated optical density,IOD)。�
1.7 透射电镜标本制备�
心肌组织脱水,浸透聚合。行超薄切片并用2%醋酸铀及枸橼酸铅染色,透射式电子显微镜(日立�H-7650)观察摄片。�
1.8 统计学分析�
所有数据均以�x-±s表示,应用SPSS 12.0软件包进行统计学分析。各组间比较采用随机区组设计的方差分析,相关性用线性相关分析。�
2 结果�
2.1 大鼠一般情况观察�
与CN组比较,DM组明显消瘦,多饮、多尿,精神萎靡,活动减少,毛发枯黄、无光泽,第6周出现白内障。�
2.2 超声指标变化�
各组大鼠LVEF未发现明显差异(P>0.05)。IBS% DM组明显高于CN组(P0.05);24周时CVIB CN组为6.3,DM组明显降低(4.1),IBS CN组为18.7,DM组明显升高(�22.5),两组比较均有显著性差异(均P[2]。正常情况下左心室约有2 000万个心肌细胞,心肌细胞坏死超过750万并被胶原纤维取代,心功能即失代偿,这可能是导致心力衰竭的病理基础。迄今为止,已知成年动物和人类心肌组织中胶原至少有5种类型,即Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型。各型胶原的相对比例在不同种属动物的心肌中有些差异,但都以Ⅰ、Ⅲ型为主。Ⅰ型胶原纤维粗大,互相融合,排列致密,主要分布于心内膜、心瓣膜、心外膜、肌束膜和大血管壁外层,抗拉强度高,而伸展性和回缩性小,决定心肌舒张收缩的僵硬度;Ⅲ型胶原纤细,呈细网状排列,主要分布于心肌细胞之间、小血管周围间隙及心外膜下,伸展性和回弹性较大。两型胶原往往同时存在,在生理状态下,处于不断合成和降解的动态平衡中,随着年龄增长,代谢减慢,组织胶原量逐渐增多;但在病理条件下,二者转换失衡,导致心肌间质纤维化。�
本实验结果显示,DM组12周和24周组胶原含量均显著高于CN组,表明早期即出现胶原的增生。且主要是Ⅰ型胶原在细胞间质的广泛、弥漫性表达并进行性增多,使DM大鼠心肌僵硬度增加,这与文献[2]报道一致。Ⅲ型胶原表达先有增加,24周后减少。因HPC在胶原中含量较恒定(12.7%),故本研究应用HPC反映心肌胶原总含量。Masson定性分析显示自第4周起,DM组胶原含量明显高于CN组,这是DCM的直接证据。超微结构亦可见DM组随病程延长心肌间质内成纤维细胞增生,大量胶原微纤维成束出现。�
IBS技术是近年来发展起来的无创超声诊断技术,通过探测组织的声学参数来定量描述正常和病理组织的特性,从而评价与分析组织病理结构的类型和程度[3]。IBS偏重于反映静力学(如MF、水肿、坏死等)变化,而CVIB偏重于反映动力学(与心肌收缩力相关的如肌节长度、肌纤维方向等)变化,与收缩功能有关〔1〕。国外学者[4-6]也发现CVIB值随着心肌收缩力的变化而变化,一旦CVIB值发生了明显改变,也就表明心肌组织的收缩功能发生了改变。因为IBS值与心肌纤维方向与超声束之间的夹角有关,显示了声学特征的角度依赖性。平行时散射最小,垂直时散射最大,在左心室长轴和短轴切面的前间隔和后壁可获得稳定的IBS和CVIB,而在其他切面及其他室壁心肌变异较大。因此,本试验以左室后壁作为观测点。�
本实验IBS显示,自4周起DM组IBS%较同期CN组显著增高,随病程延长逐渐升高。可能系DCM大鼠心肌细胞及血管周围胶原纤维增多,造成散射原排列紊乱,ROI区散射原密度增多,从而引起IBS增加。相关分析显示,IBS%与MF指标HPC、CVF、PVCA、胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达呈正相关,可以用来评价MF,IBS技术可以用来反映DCM不同发展阶段心肌的组织学损伤。同时也说明在高血糖环境中4周已出现胶原纤维增多,IBS可以早期发现这种变化,是较敏感的指标。CVIB在第4周时尚无明显变化,12周时有所下降,但未有统计学意义,第24周LVEF尚处在正常范围时,CVIB可见明显下降,说明在24周时DCM大鼠心肌收缩功能储备已下降。与苗雅等〔7〕报道的结果类似。超微结构显示,肌丝的大量丢失必然导致心肌收缩功能降低,线粒体增生表明能量代谢紊乱,可致心肌顺应性降低。其机制可能为:糖尿病使机体能量代谢障碍,心肌纤维化,致其僵硬度增加,顺应性减低;细胞及血管周围纤维增多可影响心肌兴奋性及传导,并使氧的弥散距离加大从而增加心律失常、心肌缺血的危险性,使心功能下降。因糖尿病心肌病早期无临床症状和体征,临床上有明确的早期诊断是困难的。若在亚临床阶段利用IBS技术即得到诊断并客观评价左室功能,早期采取有效措施防止心脏功能进一步受损,对延缓DC的发展及改善预后将有重要意义。
综上所述,胶原蛋白Ⅰ持续性增加是DCM模型鼠MF的主要原因。IBS%可以早期发现DCM,并监测MF程度。通过对CVIB的监测,可以反映中晚期DCM心肌收缩功能的储备。IBS技术有望成为临床上评价MF的重要方法。�
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[收稿日期] 2009-02-08
