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【摘要】 目的 探讨硝酸甘油(NG)对大鼠缺血性脑缺血再灌注中Akt和Bad(ser136)磷酸化的影响。方法 36只健康SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(对照组)、硝酸甘油组。以大鼠四肢动脉结扎脑缺血模型为基础，应用焦油紫染色法检测海马CA1区神经元凋亡，采用免疫印迹检测Akt和Bad(ser136)的磷酸化。结果 硝酸甘油组脑海马CA1区神经元凋亡显著少于对照组(P[1]实验分离双侧颈总动脉并电凝椎动脉。手术第2天于动物清醒状态下结扎双侧颈总动脉，使全脑缺血15 min，然后再灌注不同的时间，缺血时保持其直肠温度在36.5℃～37.5℃，以缺血动物体征表现判断缺血模型的可靠性。假手术组的处理同实验组，但不结扎双侧颈总动脉。硝酸甘油组于缺血前20 min给药，腹腔注射硝酸甘油5 mg/kg。
1.3 焦油紫染色 甲组于再灌注第5天，以水合氯醛麻醉大鼠，接着以生理盐水和4%多聚甲醛进行心室灌注。取脑组织在4℃多聚甲醛中固定1 d以上后，于梯度乙醇溶液中脱水并在二甲苯中透明。包腊后的脑块进行切片(5 μm)，经脱蜡、二甲苯，最后放于焦油紫溶液中染色。取海马CA1区1 mm内的细胞数量作为计数标准。
1.4 Akt和Bad(ser136)磷酸化免疫印迹检测 乙组于再灌12 h将大鼠快速断头取脑，分离双侧海马，置液氮中冻存备用。以下操作均在冰水浴中进行。从液氮中取出海马，加1.7 ml匀浆缓冲液，用Teflon匀浆器高速匀浆(10 s×6次)，800 g×10 min离心，弃上清液，加入0.6 ml buffer B振荡摇匀，12 000 g×10 min离心，取上清，按改良Lowry法，以牛血清白蛋白为标准蛋白测蛋白，经过计算，各组样品配成相同蛋白浓度后分装，置-80℃冰箱待用。等量蛋白样品经7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，以湿转法电转移至NC膜上，转移缓冲液：25 mmol Tris，190 mmol甘氨酸，20%甲醇和0.05%SDS。转移后的NC膜经封闭液室温封闭3 h后加入一抗p-Akt、p-bad(ser 136)，4 ℃过夜。用洗涤液洗膜三遍，加入二抗羊抗兔IgG-AP，37℃反应2 h，洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。用图像处理仪(Gene Company)对结果分析处理，假手术组的灰度设为1，其他各组以假手术组为标准分别计算出相对值。
1.6 统计学方法 以 SPSS 11.0统计软件进行分析处理。所有数据经检验方差具有齐性，以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P
2.1 神经元凋亡 假手术组海马CA1区仅仅有少量细胞凋亡，对照组凋亡细胞与假手术组相比明显增多(P[2]。本实验结果证明：硝酸甘油可以明显上调12 h时Akt和Bad(ser136)的磷酸化水平，减少神经元凋亡，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。
参 考 文 献
[1] 宋远见，裴冬生，孙亚峰，等.脑缺血再灌注后依达拉奉联合黄芪对大鼠神经元的保护作用及机制.山东医药，2008，48(22)：6-8.
[2] Wang XT，Pei DS，Xu J，et al.Opposing effects of Bad phosphorylation at two distinct sites by AKT1 and AKT on ischemic brain injury.Cell Signal，2007，19(9)：1844-1856.
