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【摘要】 目的对子代大鼠进行产前束缚应激刺激,观察产前束缚应激刺激对子代大鼠空间学习记忆和运动能力的影响。 方法在母鼠怀孕的13~19 d,进行3次/d束缚应激,45 min/次。于雌、雄仔鼠1月龄时对其进行Morris水迷、悬吊实验和斜坡实验。 结果Morris水迷宫实验中,应激组与对照组相比,寻找站台的潜伏期有明显的延长, P [1]。本研究以慢性束缚应激作用于大鼠,选择怀孕中后期施加应激刺激,在子鼠1月龄时应用Morris水迷、悬吊实验和斜坡实验。观察束缚应激刺激对子代的空间学习记忆和运动能力的影响。 �
1 材料与方法�
1.1 动物模型建立 本实验使用西安交通大学医学院实验动物研究中心提供的SD大鼠,体重(雌性体重220~250 g,雄性体重250~270 g),性成熟。正常饲养7 d,使其适应周围环境。然后于晚11:00点雌雄4:1合笼,第2天早7:00阴道涂片检查,有精子者取出单笼饲养,记为孕0 d。并随机分为应激组和对照组,应激组正常饲养至孕第13天,开始施加束缚刺激,每天白天使大鼠钻入一直径7 cm,长19 cm的圆柱形容器中,容器上打多个孔,供大鼠呼吸之用。3次/d,45 min/次,时间随机,持续到孕第19天停止。对照组则正常饲养。待母鼠生产后,当天则记为产后第1天。产后第21天断奶,雌雄分笼喂养,分为雌性应激组(SF),雄性应激组(SM),雌性对照组(CF),雄性对照组(CM)。�
1.2 Morris水迷宫实验 本实验应用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆的能力。Morris水迷宫是目前公认的较权威的检测大鼠空间学习记忆能力的方法。实验区是一直径为120 cm,深50 cm的圆形水池,其底面和四壁用油漆涂成黑色。池壁上标有东西南北四个入水点,他们将水池分为四个象限,分别为一、二、三和四象限,在第一象限,据池壁35 cm处放一直径9 cm,高40 cm的圆形透明平台,然后往池中放水,池内水深41 cm,高于平台1 cm,水温保持在(25±1)℃。
定位航行实验(place navigation),用于检测大鼠水迷宫学习记忆能力。共历时5 d,每天分上、下午两个时间段,每时段训练4次,直到第5 天上午,共9 个时段。训练时使大鼠分别从各象限入水,入水时使大鼠面朝桶壁。入水后大鼠会尽力寻找水中的站台,如找到站台,应使其在站台上停留3 s以上,则从入水开始到找到站台的时间记为潜伏期;如一直不能找到站台,则在120 s时将大鼠提出,放到站台上,停留5 s以上,然后拿出。此时潜伏期记为120 s,并根据大鼠在水中搜索站台的游泳轨迹确定其每次的搜索策略。寻找站台的策略分为边缘式、随机式、趋向式和直线式。直线式以大鼠入水后找到的第一个点与站台之间的连线为中轴,如果大鼠的所有运动轨迹点与中轴的距离均不超过一定的范围,即确认该运动策略为直线式。趋向式与直线式的策略相似,只是距离取的更大。边缘式是以大鼠的运动区域的中心为圆心,取一定的半径作一个圆,如果大鼠的大部分轨迹点均在该圆外,则认为大鼠此次的运动为边缘式。若大鼠的运动策略不是以上三种则认为是随机式。本实验将直线式、趋向式和边缘式的范围值分别定为15、50、75,大鼠在设定区域中的运动时间至少占总时间的70%。�
1.3 悬吊实验 让大鼠前腿抓住一水平玻璃棒(直径0.5 cm),离开桌面50 cm,使其悬空,记录大鼠掉落的时间。评分标准:5 min,5分。�
1.4 斜坡实验 将大鼠头向下置于45°斜面上,记录大鼠转为头向上角度大于135°的时间。�
1.5统计学分析 结果以( x ±s )的形式表示。然后应用统计学软件SPSS10.0对结果进行处理。分别采用重复测量的单因素方差分析One�way RANOVA和Nonparanetric tests中的Mann�Whiteney秩检验比较组间差异, P 0.05)。
表1
注:与CF组相比�* P 0.05)。但对随机式策略的选择上,SF组与CF组相比,SM组与CM组相比,应激组明显多于对照组,差异有统计学意义( P 0.05)。�
图2 不同搜索策略出现次数
2.2 悬吊实验和斜坡实验 应激组与对照组相比悬吊实验得分较低,斜坡实验用时延长( P 导致这种差异的原因,可能与产前的应激刺激导致母鼠体内以糖皮质激素(GC)为代表的一系列应激激素的增加有关[2]。实验发现[3],长期慢性刺激可导致母体和胎儿的基础皮质酮水平提高。GC本身可以直接与脑海马区相应的受体结合,导致海马区神经元的损伤。
研究表明,应激可以明显的影响海马LTP的产生。急性应激只能短暂性地影响海马功能,之后可完全恢复正常。而慢性应激依据其作用方式和作用时间的长短,对海马会产生不同的影响,严重的会造成永久性损伤,导致学习记忆能力持续低下。Pavlides[4]等的研究则发现,受到慢性束缚应激刺激的大鼠,其海马CA3和DG区的LTP被明显的抑制,而急性应激刺激对LTP没有影响。长期慢性应激还会使大鼠海马DG神经元萎缩,对LTP造成不可逆转的损害。表明慢性应激的时间越长,对海马LTP的损害越重。尽管研究结果略有差异,但应激刺激尤其是慢性应激刺激可导致LTP的损失已得到公认。虽然大鼠出生后,随着脑的不断发育,海马神经元进行性的增加,但Lemaire等[5,6]的研究发现,产前受到束缚应激刺激的子代大鼠,其出生后海马区神经元也会不断增殖,并随着年龄的增长,增殖速度下降,但较正常子代大鼠增殖速度下降更为明显,并最终表现为空间学习记忆能力的受损。所以,产前的束缚应激刺激可抑制脑海马神经元的生长和发育和海马神经元LTP正常产生,导致其空间学习记忆能力的下降,表现为在Morris水迷宫实验中,子代大鼠寻找站台的潜伏期明显延长,且在策略的选择上多选择较为低级的搜索策略。
在证实产前束缚应激可降低子代大鼠空间学习记忆能力的基础上,我们考虑机体GC水平的升高应该不仅影响海马的生长发育,对其他脑区是否也会有一定影响,进而导致子代大鼠出生后其他方面功能的障碍,于是我们又进一步探讨了产前束缚应激对子代大鼠运动能力的影响。通过实验发现,在悬吊实验和斜坡实验中,无论雌雄,应激组的表现明显比正常对照组差,可以推测产前束缚应激造成了子代大鼠的运动系统的损伤。在Canu[7]等的实验中,产前束缚应激可以加重模拟失重造成的大鼠运动能力的障碍。他们认为稳定的产前环境对于子代感觉运动系统的发育和成熟至关重要,会使子代在儿童期对环境有更好的适应能力。
我们认为,产前束缚应激提高机体GC基础水平,可能会引起运动神经中枢细胞的凋亡或细胞内蛋白表达的异常,最终导致子代运动神经系统发育的异常,影响其出生后运动能力的发育。总之,产前应激刺激不但可以导致海马发育的异常,导致子代大鼠空间学习记忆能力的下降,同时也可能通过影响运动中枢的发育,导致子代大鼠运动能力的下降。由此可见,产前应激刺激对脑发育的影响并不局限于海马区,对运动中枢也可能一定的损伤。其机制有待进一步探讨。
参 考 文 献 �
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