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[摘要] 目的 探讨传统中药冬虫夏草对糖尿病肾病（DN）肾小球系膜细胞增殖的影响及该药延缓DN进展的作用机制。方法 选取人肾小球系膜细胞（HMC）为研究对象，运用细胞培养实验方法，观察高糖刺激下HMC的增殖变化，并运用中药冬虫夏草发酵菌粉药物血清进行体外干预，观察中药冬虫夏草发酵菌粉对高糖培养下HMC增殖的影响，并运用MTT比色法检测细胞存活和生长、运用反转录RT-PCR（reverse transcription PCR）方法检测TGF-β1基因。 结果 冬虫夏草及福辛普利药物血清干预后24h和48h后，对高糖培养细胞增殖具有不同程度抑制，在相同作用时间下各冬虫夏草药物血清高、中、低剂量组与正常对照组比较具有统计学意义（P＜0.01）；与高糖组比较具有统计学意义（P＜0.01），通过高糖培养mRNA的表达增加，明显高于正常对照组（P＜0.05）。结论 冬虫夏草发酵菌粉延缓DN进展可能是通过抑制高糖下HMC的增殖、下调TGF-β1基因表达延缓肾小球硬化实现的。
[关键词] 冬虫夏草；糖尿病肾病；肾小球系膜细胞
[中图分类号] R285.5；R587.1 [文献标识码] A [文章编号]1673-9701（2011） 22-11-02
The Effects of Cordyceps on Human Mesangial Cells（HMCs） in Diabetic Nephropathy
SHI Haitao 1 YANG Qingchun1 WANG Xuefeng 2 YU Haitao1 GUO Chunling1 PAN Shujie1 DONG Chunling1
1.Department of Nephrology， Daqing Longnan Hospital of Daqing Oil Field General Hospital，Daqing 163000， China；2. Rehabilitation Department， Daqing Oil Field General Hospital， Daqing 163000， China
[Abstract] Objective To investigate the effects of Dongchongxiacao on human mesangial cells（HMCs） cultured in vitro and explore the nephroprotective mechanism of Dongchongxiacao for diabetic nephropathy. Methods We get the rats serum with different concentration of medicine，and then study the effects of the serum on HMCs. the HMCs proliferation was assessed by MTT assay. RT-PCR was used to detect the expression of transforming growth factor beta 1mRNA（TGF-β1mRNA）. Results The high-dose serum can inhibit the proliferation of mesangial cells under high glucose condition at 24h，48h （P＜0.01）， The expression of TGF-β1mRNAof the high-dose are higher than control group（P＜0.05）. Conclusion Dongchongxiacao not only can inhibit high glucose-induced proliferation of HMCs，but also can decrease the secretion of TGF-β1，so to delay the progression of DN.
[Key words] Dongchongxiacao ；DN；Human mesangial cell
糖尿病肾病（dfiabetic nephropathy，DN）即糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病重要的微血管慢性并发症之一，也是导致终末期肾功能衰竭的主要原因。DN在全球范围内呈上升趋势，在西方国家DN成为终末期肾病（ESRD）的首位原因[1]。因此，对DN早发现早治疗，探寻有效地阻止DN进程的药物仍是肾病工作者的重要任务。本研究通过对传统中药冬虫夏草延缓糖尿病肾病肾小球系膜细胞增殖的研究，探讨该药对DN早期影响。
1 资料与方法
1.1 试验分组
将购买的人肾小球系膜细胞株进行细胞复苏、细胞培养、细胞传代后，选用3～10代经过鉴定的细胞随机分为正常对照组、高糖组、冬虫夏草药物血清高、中、低剂量组、福辛普利组（每组各6份细胞），采用高糖模型进行研究。
1.2 试验用药以及细胞株
冬虫夏草发酵菌粉由江西金水宝制药有限公司提供，福辛普利（蒙诺）：规格：10mg/片；批号：070511。由中美上海施贵宝制药有限公司生产。人肾小球系膜细胞（HMC）购自武汉原生原代（PriCells）生物医药科技有限公司。
1.3 实验药物血清的制备
健康雄性SD大鼠50只，体重（200±10）g，随机分为5组，即正常对照组、福辛普利组、冬虫夏草药物血清高、中、低剂量组。灌胃给药，正常组给予等体积生理盐水灌胃，每日1次，连续给药7d。给药期间，在末次灌胃2h后麻醉，在无菌条件下经腹主动脉采血，3000rpm，离心15min后取血清，56℃水浴30 min灭活补体，经0.22μm孔径的针头滤器过滤除菌，分装-20℃冻存备用。
1.4 主要试剂和相关配液
改良型RPMI-1640培养基、MTT、胎牛血清、胰酶、二甲基亚砜、青霉素、链霉素；Trizol、反转录试剂盒、Taq酶、PCR Marker、琼脂糖、TGF-β1和β-actin引物。BECKMAN GS-15R centrifuge 低温高速离心机、电热鼓风干燥箱、紫外分光光度、PCR扩增仪、水平电泳仪、凝胶成像分析系统。
1.5 引物设计与合成
根据GENEBANK中人TGF-β1、β-actin cDNA已知序列应用引物设计软件Primer5.0设计引物，由上海申工基因技术公司合成。
TGF-β1：上游引物：F5′-AGC GAC TCG CCA GAG TGG TTA-3′；下游引物：R5′-GCA GTG TGT TAT CCC TGC TGT CA-3′。
β-actin：上游引物： 5′-GTC CTC TCC CAA GTC CAC AC-3′；下游引物： 5′-GGG AGA CCA AAA GCC TTC AT-3′。
1.6 实验方法
人肾小球系膜细胞需要经过细胞复苏、细胞培养、细胞传代和细胞冻存等步骤，由相差显微镜观察以及间接免疫荧光染色进行鉴定确认后，将制备好的含药血清干预各实验分组，经过药物功能干预后的HMC，应用MTT法检测细胞增殖情况，采用酶标仪在490nm波长处各孔测吸光度（A）值。
1.7 RT-PCR方法检测mRNA的表达
取出细胞培养瓶，倒掉原液，经过将系膜细胞提取总RNA、测定提取的总RNA量、扩增产物的鉴定－琼脂糖凝胶电泳分析：用VILBER LOURMAT型成像系统进行分析，分别测量TGF-β1和β-actin电泳条带的光密度和面积，以TGF-β1、与β-actin比值代表TGF-β1基因mRNA表达水平。
1.8 统计学处理
实验数据用SPSS16.0统计软件进行统计分析，实验结果以均数±标准差（χ±s）表示，多组间数据比较用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较方差齐用配对t检验，方差不齐用Dunnett’s检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
冬虫夏草及福辛普利药物血清干预后24h和48h后，对高糖培养细胞增殖具有不同程度抑制，在相同作用时间下其各组与正常对照组比较具有统计学意义（P＜0.05或P ＜0.01）；与高糖组比较具有统计学意义（P ＜0.05或P ＜0.01），通过RT-PCR方法检测mRNA的表达，说明正常人肾小球系膜细胞存在TGF-β1 mRNA表达，说明TGF-β1参与是细胞生理活动；通过高糖培养mRNA的表达增加，明显高于正常对照组。说明高糖状态刺激肾小球系膜TGF-β1的表达。见表1、表2。
3 讨论
冬虫夏草是一种名贵的药用真菌，属肉座菌目麦角菌科虫草属植物，为虫草菌的子座与其寄主蝙蝠蛾幼虫尸体的复合物，俗称虫草。随着科学技术的不断进步与发展，近年来冬虫夏草用以治疗DN受到临床和许多学者重视。它含有丰富的蛋白质、多种氨基酸、糖类、醇类、核昔类、维生素、微量元素、有机酸等成分[1]。研究发现冬虫夏草可通过降低链脲佐菌素所致糖尿病动物模型血肌酐、血胆固醇、血Ⅳ型胶原水平抑制肾组织纤维化，减轻肾脏病理变化对早期糖尿病肾病大鼠肾损伤，起一定保护作用[2-4]。此外，冬虫夏草对高糖环境下肾小球系膜细胞（GMC）分泌的CoI、CoIIV、纤维连接蛋白、透明质酸及层粘连蛋白有明显抑制作用，抑制GMC肥大和细胞外基质（ECM）合成增加，有望用于糖尿病肾病防治[5]。
TGF-β1是一种与DN发病密切相关的生长因子，可促进ECM合成，抑制基质降解，参与了肾间质纤维化的各个环节，在DN肾小球硬化和系膜基质堆积中起着关键作用。高血糖刺激ECM的形成主要是通过TGF-β途径，Oh等[6]研究显示，高糖与大鼠肾小球系膜细胞培养6h即可显著增加TGF-βmRNA表达并继续增加至48h，TGF-βmRNA在6h时为对照的1.5倍，高糖不仅刺激TGF-β的产生，亦可上调TGF-β受体。
本研究结果显示，冬虫夏草及福辛普利药物血清干预后24h和48h后，对高糖培养细胞增殖具有不同程度抑制，在相同作用时间下冬虫夏草各剂量组与正常对照组比较具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01 ）；与高糖组比较具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），通过RT-PCR方法检测mRNA的表达，说明正常人肾小球系膜细胞存在TGF-β1mRNA表达，说明TGF-β1参与是细胞生理活动；通过高糖培养mRNA的表达增加，明显高于正常对照组。说明高糖状态刺激肾小球系膜TGF-β1的表达。而冬虫夏草及福辛普利药物血清干预后，可以显著抑制TGF-β1mRNA的基因表达，通过本实验结果推测冬虫夏草发酵菌粉可能是通过抑制高糖下HMC的增殖、下调TGF-β1基因表达延缓肾小球硬化[7]。但本研究仅通过对传统中药冬虫夏草延缓糖尿病肾病肾小球系膜细胞增殖进行初步探讨，其对DN的肾脏保护作用机制远未明确，尚有待更为全面、系统、深入的研究。
[参考文献]
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[3] 龚伟，黎磊石，陈丹，等.百令（冬虫夏草）对糖尿病大鼠转化生长因子β及其受体表达的影响[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2006，15（4）：329-339.
[4] 胡杨青，周巧玲，刘抗寒，等.冬虫夏草对糖尿病肾病鼠肾组织转化生长因子表达的影响[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2005，14（5）：413-417.
[5] 肖朝华，周建华，吴衡生.多球壳菌素对高糖诱导肾小球系膜细胞肥大及细胞外基质合成的影响[J].实用儿科临床杂志，2006，21（5）：268-270.
[6] Oh JH，Ha H，Yu MR，et al. Seqiential effects of high glucose on messangial cell transforming growth factor-beta 1 and fibronectin synthesis[J]. Kidney Int，1998（3），54：1872-8
[7] 高玉梅，刘国平. 冬虫夏草对肾脏的保护作用研究进展[J].医学综述2010，16（2）：289.
（收稿日期：2010-08-18）
