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【摘要】 目的 探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) 的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法 通过梯度分离获得成年大鼠MSCs ,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE) 、神经丝蛋白(NF) 、胶质纤维酸性蛋白( GFAP) 和神经巢蛋白(Nestin) 的表达情况，流式细胞仪检测分析诱导率。结果 BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高(49． 7%)。结论bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。�
【关键词】 骨髓;间充质干细胞;诱导分化;神经元样细胞��
To facilitate the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neuronlike cells ZHU Fu-liang,JING Cheng-wei.Department of Orthopaedics, the 2nd Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China �
【Abstract】 Objective To explore the means of transdifferentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSC) of adult rat to neuronlike cells in vitro. Methods BMSCs which were isolated from adult rats using gradient cent rifugation and subculture differentiation were induced into neuronlike cells by cytokine and oxidane. Immunocytochemistry analysis a examination was performed.about neuron specific enolase(NSE)、neurofilament protein (NF) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) and flowing cytometry analysis examination was perfpomed inductivity. Results The BMSC could be transdifferentiated to neuronlike cells with the expression of Nestin. The inducible rate of BMSC with basic fibroblast growth factor (bFGF)、butylated hydroxyarisol(BHA) was 49．8% .Conclusion bFGF、BHA can facilitate the process of BMSC being differentiated into Neural precursor cells.�
【Key words】 Bone marrow; Mesenchymal stem cells; Induction differentiation; Neuronlike cells
探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs) 的体外分离、纯化、扩增、传代培养及定向诱导分化为神经元样细胞的更好方法,为BMSCs 在神经系统疾病的临床应用提供理论依据和技术方法。�
1 材料与方法�
1．1 材料和试剂 成年Wistar 大鼠,体质量120 g 左右。Percoll 分离液(美国Pharmacia 公司) , 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF ,R &D 公司) ,β2巯基乙醇(β2ME) 、硫代甘油、叔丁基对羟基茴香醚(BHA) 、二甲基亚砜(DMSO , Sigma 公司) , 兔抗大鼠神经元烯醇化酶(NSE Maxim 公司)多克隆抗体、兔抗大鼠神经丝蛋白(NF2 Maxim公司) 多克隆抗体和胶质纤维酸性蛋白( GFAP Maxim公司) 多克隆抗体及兔抗大鼠神经巢蛋白(Nestin , Pharmingen 公司)多克隆抗体。 �
1．2 原代及传代培养 取成年的Wistar 大鼠两侧股骨及胫骨,去两端后将腔内骨髓细胞冲出,利用Percoll 分离液(1．073×10�3 g/ml) 进行梯度分离后,取含BMSCs 的低密度层到MSCGM(骨髓间充质干细胞专用培养基) 中,在37 ℃,体积分数为5 %CO2 ,95 %湿度常规培养。细胞达90%融合后传代。�
1．3 定向诱导MSCs 分化
取3～5 代的BMSCs 按0．4 ×10�6/ ml 接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片,对照组采用方法a :1 mmol/ L 硫代甘油的DMEM(10 %FBS)预诱导24 h,更换培养液,PBS 洗涤3 次,再加入含5 mmol/ L 硫代甘油的无血清DMEM诱导5 h～6 d。诱导出神经元样细胞最多时换用神经细胞培养基。实验组采用方法b预诱导试剂为10 ng/ ml bFGF ,正式诱导试剂是200 μmol/ L BHA ,其他条件不变。�
1．5 镜下对神经前体细胞进行形态学观察。�
1．6 细胞免疫组化检测 诱导前后行细胞免疫组化检测。�
1．7 流式细胞仪对神经前体细胞检测 在MSC被诱导5 h,、1 d及6 d的3个时间点上分别进行流式细胞术检测,各时间点样本均为5例。FCM检测或制片后荧光显微镜下观察。�
2 结果�
2．1 BMSCs的形态学观察 倒置显微镜下可见接种24 h 以后,骨髓中体积较大的单个核细胞贴壁,骨髓中的造血干细胞不贴壁。原代培养36～48 h 后贴壁的单核细胞始增多,72 h 后细胞开始增殖。5～6 d 左右,细胞逐渐形成分散的集落,称之为细胞集落。10～12 d左右,细胞集落间相互融合成单层,排列有一定方向性。经传代的BMSCs 呈圆形,迅速贴壁,伸展,重新变为梭形或扁平型细胞。传代培养过程中,5 代以前的细胞倍增时间约为4～6 d ,10 代以后细胞增殖能力有所减弱,胞体变得更为扁平,若加入bFGF ,则可维持其增殖能力和形态。�
2．2 BMSCs向神经元样细胞转化过程中的形态变化 预诱导24 h 后,原来梭行的BMSCs 胞体已发生收缩,细胞边缘变得不规整,有许多细的突起。诱导2 h 后,少数BMSCs 出现明显的形态变化,胞质向核收缩,呈典型的核周体形态;在诱导后5～24 h 中, BMSCs 呈渐进性的向神经元样细胞转化,诱导24 h 后,大多数BMSCs 变为典型的神经元样细胞,其胞体向胞核收缩成锥形,有较多的长突起,有些长突起末端形成生长锥样的膨大及丝性伪足。�
2．3 免疫细胞组化分析 神经元样细胞的胞体及部分突起NSE、NF 和Nestin 染色呈阳性(棕色) ,而未分化的扁平BMSCs 为阴性。GFAP染色为阴性。对照组中BMSCs 形态基本无变化,也不表达NF。�
2．4 流式细胞仪检测分析 采用上述方法可以诱导出神经元样细胞(表达nestin) ,实验组5 h、1、6 d的诱导率显著高于对照组( P[1] 。将BMSCs 直接注入神经损伤处, 可明显改善其神经功能[2]，BMSC静脉注射可转化为神经样细胞并在脑室存活[3]。�
体外定向诱导研究发现:在无血清的DMEM中加入2-巯基乙醇、硫代甘油等试剂诱导5 h 后,BMSCs 转变为神经元样细胞,但该细胞的存活时间较短。本实验基于以上发现并进行改进,采用bFGF进行预诱导, bFGF 可能参与骨髓BMSC向神经元分化的启动[4] ,对神经干细胞的增殖也有作用。本实验表明, bFGF可加速其向神经前体细胞分化的过程。在正式诱导时加入BHA为强抗氧化剂,对骨髓BMSC定向诱导作用、能将细胞从氧化状态中释放出来。如应用膜片钳技术检测,被诱导的细胞可具有早期神经干细胞电流特性，说明采用诱导体系有其应用的可行性。�
流式细胞分析分化率以诱导5 h 最高,之后nestin表达下降。nestin是一种中间丝蛋白,在神经前体细胞的早期阶段表达,随着细胞发育成熟表达量降低。骨髓MSC在细胞因子和氧化作用下,被诱导分化时是相对迅速的过程,即发生了分子和蛋白水平上的变化,从而形态发生改变。但何种机制造成了这种改变目前尚不清楚,掌握了这种分化机制就可以使BMSCs大量表达nestin时阻止进一步分化,并保持这种状态,从成体骨髓中获取神经干细胞。�
本实验为BMSCs的临床应用提供理论和技术支持，可以认为骨髓源性干细胞具有良好的临床应用前景[2、3、5]。MSCs表达生殖系及三个胚层的基因,这是其可以转分化的基础[6]。而MSCs分化成神经元样细胞可能包含许多不同基因细胞因子之间的复杂调节，其确切机制尚待进一步研究。�
参考文献
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