【www.zhangdahai.com--庆典致辞】
【摘要】 端粒酶是一种特殊的逆转录酶,能以自身的RNA为模板,反转录成端粒的重复单元TTAGGG加到人染色体末端,阻止端粒随细胞分裂而缩短,使细胞绕过衰老途径成为永生化细胞,导致人类肿瘤的发生。以端粒酶为靶点,可以有多种治疗途径,本文主要介绍了端粒酶抑制剂的研究现状及进展,重点对最新型的寡核苷酸类及G�四联体稳定剂类端粒酶抑制剂进行介绍。
【关键词】端粒;端粒酶; G�四联体;寡核苷酸
近年来,端粒及端粒酶的研究已成为生物学热点,也是人类抗肿瘤药物研究的新“靶点”。根据目前已经检测出的肿瘤组织标本的统计学分析,恶性肿瘤组织端粒酶活性的阳性率达到85%~95%,而良性肿瘤和正常组织的端粒酶活性检出率仅为4%左右[4]。因此,端粒酶抑制剂的开发成为了抗肿瘤药物研究的又一热点。
1 端粒及其在DNA复制过程中的作用
端粒(Telomere)是由位于真核细胞染色体末端的DNA及蛋白质构成的天然末端,是由富含鸟嘌呤(G)的核苷酸经5’3’方向串联组成。不同物种端粒的重复序列和长度不一样,但每种生物体都有其特定的序列和平均长度。人类端粒重复序列是5’TTAGGG3’,端粒长度在5~15Kb之间[5]。
端粒有维持染色体稳定和基因组完整的功能,防止染色体末端被化学修饰或被核酸降解、端端融合和重排,并参与染色体在核内的定位及基因表达调控[6]。研究证明,端粒与细胞的寿命密切相关。细胞分裂时,胚系细胞可以重建与延长端粒DNA,而体细胞则随着细胞的分裂,端粒不断缩短,缩短速度为50~200 bp/次分裂。当其长度减小到一定的临界值时,细胞即趋向于衰老、死亡,因此,端粒被认为是绝大多数体细胞的“生物钟”[7]。
2 端粒酶及其与肿瘤发生的关系
端粒酶(Telomerase)是位于细胞核内的一种逆转录酶[9],由人类端粒酶RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白1(hTP1)和端粒酶逆转录酶(hTERT)三部分构成。hTR 序列可以与人端粒序列(TTAGGG)n 互补[10],端粒的延长即通过该区与端粒DNA 结合后完成; hTP1主要功能是调节端粒酶活性;在多数情况下,hTERT 的表达是端粒酶活性的限速步骤,但也并非完全一致在卵巢和子宫组织中,可以检测到hTERT及hRTmRNA的出现,但并不具有端粒酶的活性[11]。
端粒酶能以自身的RNA为模板,反转录成端粒的重复单元TTAGGG加到人染色体末端,阻止端粒随细胞分裂而缩短,使细胞绕过衰老途径成为永生化细胞,导致人类肿瘤的发生[12]。
许多证据表明,除了生殖细胞、胚胎干细胞、活化的淋巴细胞、月经期的子宫内膜组织及表皮的基底层细胞外,大部分的体细胞端粒酶呈阴性[13],而在约80%~90% 的人类肿瘤中端粒酶激活。调查表明,端粒酶在各种肿瘤中的阳性率分别为[14]:中腔鳞状细胞癌80%~90%,食道癌87%,胃癌85%,肺癌80.11%,肝癌85%,乳腺癌85%,肾癌71%,胰腺癌95%等。说明端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的相关性。
然而端粒酶的活化并不是癌症的动因,端粒酶自身并没有能力引起正常细胞的癌变,端粒酶活化的细胞还需要诸如原癌基因等许多因子的作用,端粒酶的激活也需要其他因子的参与[15]。hsp90、P23、TEP1等均对端粒酶的活性具有调节作用[11]。另外,端粒酶的活化也并不是肿瘤恶性所必须的,约有15%的肿瘤为端粒酶阴性,如胶质瘤[16]。还必须注意到许多肿瘤细胞可以通过其他非端粒酶机制对端粒的长度产生影响,成为ALT细胞,大约有10%的肿瘤细胞存在这种机制[17]。
端粒酶激活有两种模式:反应模式和扩展模式。前者依赖端粒的长度,肿瘤细胞主要来自端粒酶阴性的前体细胞,当端粒缩短到一定程度后才会激活端粒酶;后者不依赖端粒的长度,肿瘤细胞主要来自具有端粒酶活性的细胞群,在肿瘤发生中出现较早。多数学者认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持,避免了细胞正常的复制衰亡机制的制约而获得永生化[16]。
3 端粒酶的检测方法
早期的检测方法主要是通过检测端粒DNA限制性酶切片段长度或检测端粒酶RNA的丰度。缺点是检测灵敏度低。
1994年,Kim[14]等用去活剂进行细胞提取,并将端粒酶催化反应产物进行PCR扩增,建立了PCRTRAP法,极大地提高了端粒酶检测的灵敏度。
该方法原理是用PCR扩增端粒反应的3’末端引物,在端粒酶的催化下延伸,增加TTAGGG重复序列,再将这种端粒酶反应产物进行PCR扩增,表达量可提高104倍。用银染色法、荧光标记、生物素标记、酶联免疫吸附法(ELISA)就可检测,不用放射性同位素显示,同样有较好的效果。
利用端粒酶比其他肿瘤标志物更直接、特异性更强,且TRAP法是以PCR为基础而建立的,故敏感性高,只要反应体系中有5个以上肿瘤细胞,即可检测到端粒酶活性[15]。
除上述直接测定端粒酶活性的方法外,还可通过检测TETR的mRNA或蛋白表达来间接检测端粒酶活性。主要检测方法包括:原位杂交法,RTPCR法,以及免疫组织化学方法等[7]。
4 端粒酶抑制剂
研究人员热衷于对端粒酶作为药物靶点进行研究的原因有二:第一是端粒酶在大多数肿瘤细胞中高表达,但在正常细胞中的表达则很少;第二是因为肿瘤细胞中端粒的长度要远低于正常细胞,一旦选择性抑制端粒酶活性,则肿瘤细胞将比正常细胞更快死亡[8]。还有一点不容忽视,就是相对于其他类型的抗肿瘤药物,肿瘤对于端粒酶抑制剂类不易产生耐药性[22]。
根据作用位点的不同,将此类药物分为五类:端粒酶抑制剂、主动免疫疗法、端粒瓦解剂、自杀基因疗法、阻断端粒酶的表达及生物合成的试剂[23]。笔者主要对端粒酶抑制剂进行介绍。
4.1 核苷类逆转录酶抑制剂[17] 端粒酶是一种高度特异化的逆转录酶。序列比对的结果显示,逆转录酶的聚合酶位点与端粒酶的催化亚基具有高度同源性,由此自然想到可以利用逆转录酶抑制剂来抑制端粒酶活性。
端粒酶在催化合成端粒DNA 的过程中,常需4种三磷酸单核苷酸的参与,利用一些核苷酸类似物可竞争性抑制端粒酶的反转录过程,使其活性抑制并阻止端粒的延长。逆转录酶抑制剂(ddG和AZT等)就是通过与三磷酸单核苷酸竞争与端粒酶的结合位点发挥其作用的。
AZT在治疗T细胞白血病(Tcell leukemia)上取得的效果揭示了核苷类逆转录酶抑制剂作为抗肿瘤药物的成功[24]。AZT的治疗效果主要是端粒酶抑制,端粒长度缩短,p14(ARF)表达量的增加。最近的一项研究显示,AZT还可以作为放射疗法中的增敏剂[8]。
图1 核苷类逆转录酶抑制剂
4.2非核苷类小分子抑制剂 这类小分子主要是与端粒酶的催化亚基端粒酶逆转录酶hTERT相互作用。
MKT077是一种毒性丹菁染料的类似物,能够选择性累积于肿瘤细胞,发挥其端粒酶抑制功能。以MKT077为先导化合物开发出了活性更强的FJ5002。其IC�50值约为2 μm。在人白血病细胞系U937的培养液中加入亚急性浓度的FJ5002,长时间培育后,观察到细胞出现衰老和死亡的迹象,其端粒的长度由实验前的10 kb缩短到了4 kb。
BIBR1532被认为是一种很有前景的端粒酶抑制剂,由德国勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingelhei)研制。BIBR1532是一种混合型的抑制剂,可分别与脱氧核糖核苷酸及DNA引物的位点相结合,并抑制端粒酶活性[17],其IC�50�可以达到93nM。在10 μm浓度下,用BIBR1532对几种肿瘤细胞系进行处理,短时间内未观察到细胞分裂情况的改变,但经过几周的延滞期后,肿瘤细胞表现出染色体异常及形态学改变等衰老特征。Hesham El Daly等人[27]经过研究发现,在30~80 μm浓度下,BIBR1532可在几天之内诱导出细胞毒效应,并在数种白血病细胞系中得到了证实。他们还观察到在高剂量的BIBR1532作用下,肿瘤细胞内出现了TRF2缺失及p53磷酸化增加的现象[28]。Parsch,D等人利用人软骨肉瘤细胞系对BIBR1532的抗肿瘤作用进行了研究。他们发现随着剂量的增加,端粒酶的活性逐渐下降,当浓度增加到100 μm时,端粒酶的活性下降了80%。通过对照实验发现,BIBR1532确实能够降低肿瘤细胞的增殖速度,但不能使其生长完全停滞;BIBR1532只对端粒酶为阳性的细胞株有效,而对ALT型细胞无效。将BIBR1532与顺铂联合用药发现,BIBR1532并不能增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性,这显示BIBR1532对端粒酶活性的抑制程度仍不够高,因为研究发现端粒酶程阴性的肿瘤细胞对化疗药物的敏感性会增加[29]。另外还发现,BIBR1532能够增强耐药性肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[30]。
图2 非核苷类小分子抑制剂
4.3 寡核苷酸类端粒酶抑制剂[17] 寡核苷酸类药物主要是利用反义技术对hTR进行抑制。此类药物用于肿瘤治疗有两个问题需要解决:吸收度差及体内稳定性差。
为了增加寡核苷酸的稳定性,需要对寡核苷酸的结构进行修饰。方法之一就是将磷酸酯中的一个氧原子用硫原子替代,使其能够抵抗核酶对寡核苷酸的水解,使得这种硫代磷酸酯改性寡核苷酸(PSODN)作为一种反义药物广泛用于肿瘤的治疗。Pitts 和Corey 以人前列腺细胞系为实验对象,首次证实了2’O甲基RNA(2’OmethylRNA)能够直接作用于hTR的模版域,有效抑制端粒酶活性,减慢肿瘤细胞地增殖。
图3 寡核苷酸的结构修饰
GRN163 及其类似物GRN163L 是一个极其成功的寡核苷酸类模版抑制剂。GRN163 是一个长13 mer 的经过修饰的寡核苷酸,GRN163L 与GRN163相比,在其5’部位共价结合了一分子的棕榈酸。GRN163L 的这一修饰,不仅使得其更易被细胞摄取,而且其脂溶性部分还可与端粒酶的蛋白部分相结合,增强其端粒酶抑制活性。GRN163L 在组织中的活性比GRN163大七倍左右,其IC�50�为0.5~10 nM[32]。无论在体外还是体内,GRN163L对血液型肿瘤以及固态肿瘤都显示出很好的抑制作用,尤其对人体的肺癌、乳腺癌及肝癌细胞效果良好[33]。其最独特的作用在于对肿瘤干细胞的抑制作用明显[32]。GRN163L能够增强乳腺癌细胞对于辐射的敏感性,并且可以减少乳腺癌细胞的侵袭性[34]。GRN163L于2006年底由Geron Corporation申请开始临床试验,第一、二期临床选择在慢性粒细胞性白血病患者中进行,对实体肿瘤的临床试验最近刚刚开始。
4.4 G四联体稳定剂(GQuadruplex Stabilizers) 端粒中富含鸟嘌呤G,在K�+ 、Na�+ 等离子的存在下很容易形成G四联体结构(Gquadruplexes,G4)。G四联体是由G四方体(Gquartet)堆积而成。G四方体由在平面排列的四个鸟嘌呤G所构成,其中每个鸟嘌呤都作为碱基对氢键的供体和受体。
现已发现体外存在多种G四联体结构。根据它们的分子特性及螺旋取向,G四联体可以分为以下几类[35]:①平行型(parallel)G四联体;②双分子型G四联体;③自身折叠(foldover)型G四联体。双分子型和自身折叠型G四联体又包括椅式构型和篮式构型等不同结构。
图4 G四方体及G四联体
G四联体的形成使得端粒酶不能与端粒很好的结合,也就失去了其延长端粒的作用。而且这类药物不仅能作用于端粒酶阳性的细胞,而且对ALT细胞也能产生作用。因此,设计一种能够促进G四联体的形成或者稳定G四联体结构的化合物,将是肿瘤治疗研究的方向之一。
Telomestatin(SOT095)是从Streptomyces anulatus 中分离得到。其主要作用机制是高度特异性地与分子内G四联体相结合,并稳定其结构。体内实验也证实了其能使富含鸟嘌呤G的核酸链长度缩短,而且只对端粒酶呈阳性的细胞有抑制作用[21]。Telomestatin 与端粒的结合导致端粒保护蛋白POT及TRF2的移位,并使得突出的端粒末端被降解。当Telomestatin的给药浓度为5 μm 时,可以对大多数肿瘤细胞产生抑制作用,并且不会对成纤维细胞及上皮细胞的生长产生影响。而且相对于肿瘤细胞而言,正常组织细胞在给予Telomestatin后,并不会出现3’ 突出端的降解及TRF2移位的现象,这也就增加了POT及TRF2该药对肿瘤细胞的选择性[8]。
[Pt(dppzCOOH)(N∧C)]CF3SO3是香港大学的DikLung Ma等[36]新近合成的一种platinum(II)类化合物。它能够使端粒的G四联体结构折叠293倍,其体外实验显示对人端粒酶的IC�50�为760 nM。细胞毒性试验显示,此化合物的IC�50�为17~25 μm,对肺部成纤维细胞的毒性还要低10倍左右(IC�50为180 μm),并且对多要耐药性细胞KBV1及顺铂(cisplatin)耐药性细胞CNE1有很好的活性。该化合物对G四联体的亲和力比对正常的双链DNA高800倍左右,远远高出BRACO19的25倍的亲和力。
图5 G四联体稳定剂
这类药物的主要问题是安全性:活性的G四联体稳定剂可以影响正常细胞的端粒结构以及基因组中富含鸟嘌呤G的区域的稳定性[23]。
5 问题与展望
虽然目前的研究表明,各种端粒酶抑制剂对肿瘤细胞增殖有抑制效应,但是有必要强调以下几个重要方面[38]:①并非所有肿瘤患者和肿瘤类型都能检测到端粒酶的激活,可能会对端粒酶靶向的治疗方法不敏感;②在端粒酶抑制后,端粒缩短到足以使细胞生长停滞的长度需要相当时间。故在今后的临床应用中,端粒酶抑制剂需要联合其他肿瘤治疗手段;③某些正常细胞也表达端粒酶活性,端粒酶抑制剂是否对端粒酶阳性的正常细胞同样有影响尚不明了;④端粒酶抑制剂对ALT途径无效,肿瘤细胞可能会启动其他补偿机制而逃脱治疗的压力。
自从发现先天性角化不良(dyskeratosis congenita)以及再生障碍性贫血(aplastic anaemia)等遗传性疾病与端粒酶活性有关以来,通过对端粒酶进行重建以治疗该类疾病的研究就一直在进行[39]。急性疾病,例如感染及外伤等,能够增加心血管及神经系统等慢性变性型疾病的发生率,想要治愈这类疾病需要重建受损的组织。在此方面,端粒酶激活剂提供了一条可能的治疗途径[17]。
到目前为止,还没有一个端粒酶靶向药物类抗肿瘤药物成功运用于临床,只有端粒酶抑制剂类及主动免疫疗法类药物进入了临床实验。但相信端粒酶靶向治疗作为一种重要的肿瘤治疗手段终将发挥其应有的作用。
参 考 文 献
[1] Blackburn,E.H.A tandemly repeated sequence at the termini of the extraehromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymen.J.Mol.Biol,1978,12:3353.
[2] Linguer,J.Reverse transeriptase motifs in the eatalytic subunit of telomerase.Science,1997,276:561567.
[3] Morin,G.B.The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats.Cell,1989,59:521529.
[4] 丁金丽.端粒酶抑制剂的研究进展.日本医学介绍,2006,27:473475.
[5] Creider,C.W.Telomeres,telomeraseandeaneer.Seientifie Ameriean,1996,274:92.
[6] 朱庸.抗肿瘤药物端粒酶抑制剂的研究进展.海峡药学,2007,19:47.
[7] 张火俊.端粒酶抑制剂对大鼠种植性肝癌影响的实验研究.第二军医大学,2005.
[8] Parkinson E.K.Minty F.Anticancer therapy targeting telomeres and telomerase:current status.BioDrugs,2007,21:375385.
[9] Takahashi,S.ExPression of telomerase component genes in hePatoeellular carcinomas.Eur.J.Cancer,2000,36.
[10] Oder,A.I.oncogene,1997,14:10131021.
[11] 李晋芳.端粒酶及端粒酶抑制剂的研究.口腔颌面外科杂志,2007,17:285287.
[12] 姚成才.端粒酶抑制剂与肿瘤治疗研究进展.肿瘤防治研究,2004,31:6264.
[13] Cong,Y.S.Human telomerase and its regulation.Microbiol Mol.Biol,2002,66:407425.
[14] Kim,N.W.Specific association of human telomerase activitywith immortal cells and cancer.Science,1994,266:20112014.
[15] 葛晶.端粒酶和端粒酶抑制剂研究进展.生物学杂志,2006,23:811.
[16] 蒋玉艳.抗癌药物的新靶点端粒及端粒酶抑制剂的研究进展现代预防医学,2005,32:462464.
[17] Tarkanyi I.Aradi J.Pharmacological intervention strategies for affecting telomerase activity:future prospects to treat cancer and degenerative disease.Biochimie,2008,90:15672.
[18] GonzalezSuarez.E.Increased epidermal tumors and increased skin wound healing in transgenic mice overexpressing the catalytic subunit of telomerase,mTERT,in basal keratinocytes.EMBO.J,2001,20:26192630.
[19] Stewart,S.A.Telomerase contributes to tumorigenesis by a telomere lengthindependent mechanism.Proc NALT Acad Sci U S A,2002,99:1260612611.
[20] Chang,S.Telomerebased crisis:functional differences between telomerase activation and ALT in tumor progression.Genes Dev,2003,17:88100.
[21] Sampedro Camarena F.Cano Serral G.Sampedro Santalo,F.Telomerase and telomere dynamics in ageing and cancer:current status and future directions.Clin Transl Oncol,2007,9:14554.
[22] Camp,E.R.Molecular mechanisms of resistance to therapies targeting the epidermal growth factor receptor.Clin.Cancer Res,2005,11:397405.
[23] Harley,C.B.Telomerase and cancer therapeutics.Nat Rev Cancer,2008,8:16779.
[24] Datta,A.Persistent inhibition of telomerase reprograms adult Tcell leukemia to p53dependent senescence.blood,2006,108:10211029.
[25] Zhou F X,Liao Z K.Radiosensitization effect of zidovudine on human m alignant glioma cells.Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,354:351356.
[26] Feldser,D.M.Short telomeres limit tumor progression in vivo by inducing senescence.Cancer Cell,2007,11:461469.
[27] El Daly,H.; Martens,U.M.Telomerase inhibition and telomere targeting in hematopoietic cancer cell lines with small nonnucleosidic synthetic compounds(BIBR1532).Methods Mol Biol,2007,405:4760.
[28] ElDaly,H.Selective cytotoxicity and telomere damage in leukemia cells using the telomerase inhibitor BIBR1532.Blood,2005,105:14721479.
[29] Parsch D,Brassat U.Brummendorf T H.Fellenberg,J.Consequences of telomerase inhibition by BIBR1532 on proliferation and chemosensitivity of chondrosarcoma cell lines.Cancer Invest,2008,26:590596.
[30] Ward R J, Autexier C.Pharmacological telomerase inhibition can sensitize drugresistant and drugsensitive cells to chemotherapeutic treatment.Molecular Pharmacology,2005,68:779786.
[31] Tarkanyi I.Inhibition of human telomerase by oligonucleotide chimeras,composed of an antisense moiety and a chemically modified homooligonucleotide.FEBS Lett,2005,579:14111416.
[32] Shay J W,Keith W N.Targeting telomerase for cancer therapeutics.Br J Cancer,2008,98:677683.
[33] Hochreiter A E.Telomerase template antagonist GRN163L Disrupts telomere maintenance,tumor growth,and metastasis of breast cancer.Clin.Cancer Res,2006,12:31843192.
[34] De Cian A,Lacroix L,Douarre C,TemimeSmaali N,Trentesaux C,Riou J F.Mergny,J.L.Targeting telomeres and telomerase.Biochimie,2008,90:13155.
[35] 殷菲.以G四联体为靶点的小分子端粒酶抑制剂研究进展.化学通报,2004:271277.
[36] Ma D L,Che C M,Yan,S C.Platinum(II)Complexes with Dipyridophenazine Ligands as Human Telomerase Inhibitors and Luminescent Probes for GQuadruplex DNA.J.AM.CHEM.SOC,2009,131:18351846.
[37] Filaci,G.Frequency of telomerasespecific CD8+ T lymphocytes in cancer patients.blood,2005,107:15051512.
[38] 张静,刘照旭,杨金玲.BIBR1532对p53和pRb功能缺陷的肿瘤细胞生长抑制作用的研究.山东大学学报(医学版),2006,44:11131120.
[39] Marrone A,Sokhal P.Functional characterization of novel telomerase RNA(TERC)mutations in patients with diverse clinical and pathological presentations.Haematologica,2007,92:10131020.
[40] Gandellini P,Folini M.Downregulation of human telomerase reverse transcriptase through specific activation of RNAi pathway quickly results in cancer cell growth impairment.Biochem.Pharmacol,2007,73:17031714.
